石蜡切片的详细制作过程Word格式文档下载.docx
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有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合。
（6）固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。
3．脱水
生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用。
脱水剂必须能与水以任何比例相混合。
脱水剂有两类：
一类是非石蜡溶剂，如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋；
另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。
常用的脱水剂是乙醇，因为它价格便宜，易于得到。
为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般组织从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水；
对于一些柔软的组织应从15％开始。
脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。
需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。
丙酮也是很好的脱水剂，其作用和用法与乙醇相同，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。
甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。
二氧六环为无色的石蜡溶剂，对组织没有收缩及硬化等不良后果，但其蒸气有毒，使用时须小心。
正丁醇可与水及乙醇混合，亦为石蜡溶剂，其优点是很少引起组织块的收缩与变脆。
叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇，但因其价格昂贵而很少使用。
配制时应以95%酒精作为基液加水稀释,不要用无水酒精去配制,因无水酒精的价格较高,极不经济。
配制方法如下：
1．先将高浓度酒精注入量杯，其量同将要稀释酒精浓度数字相等。
2．加入蒸馏水，致总量达到原酒精浓度的数字量。
例如：
（一）用95%酒精配制成70%酒精时：
（1）取95%酒精70毫升；
（2）加蒸馏水使达到95毫升；
稀释后的酒精既为70%的酒精。
（二）
用80%酒精配制成60%酒精时：
（1）取80%酒精60毫升；
（2）加蒸馏水使达到80毫升；
稀释后的酒精既为浓度为60%的酒精.其余类推,其他的试剂的稀释也均可以参照此方法进行配制。
4．透明
组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。
透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。
透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。
通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点。
透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。
材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。
使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。
甲苯的一般性质与二甲苯相似。
用法亦同，唯沸点较低，透明较慢，但不会使组织变脆。
苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒。
氯仿适于大块组织的透明。
5．透蜡和包埋
包埋用的石蜡，熔点在50～60℃之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。
一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃，植物材料的用54～58℃的；
切片薄的用58～60℃的，切片厚的则用52～54℃的；
室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点46～48℃的石蜡，夏季可选56～58℃的。
石蜡的优劣与切片的成败密切相关。
鉴别石蜡质量的方法是：
将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕，30～35℃放置24h且无气泡和不透明的晶状小点出现，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。
这种石蜡即为品质优良。
含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点），使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。
透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。
纯石蜡应处理2～3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15～30min。
透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。
具体做法是；
先准备好纸盒（具体折法见图1-3及说明），将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。
包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。
石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶。
以后切片时引起碎裂。
6．切片
（1）石蜡块的固着与整修
在包埋以后，就可进行切片。
包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。
固着：
一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。
用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。
整修：
用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。
还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。
（2）切片机和切片刀
切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。
主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。
切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。
切片刀与切片的质量直接相关。
切片前必须磨刀，方法是：
将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上，将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨，使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。
（3）切片方法
切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。
将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。
将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°
左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。
在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。
方法是：
右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。
切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。
（4）切片中存在的问题及补救方法
石蜡切片是很不容易掌握的，有时很容易成功，有时则由于某种因素而造成切片的质量低劣，甚至完全失败。
现将切片时经常遇到的一些缺点、可能的原因以及补救办法列于表1-3。
表1-3石蜡切片可能产生的问题和解决方法
缺点：
石蜡带弯曲不直
原因：
1．石蜡块上下两边不平行
2．石蜡块的上下两边不和刀口平行
3．刀口锋利不一，局部产生差异
4．蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度不一致
5．材料未居蜡块正中央
6．材料大而形不正
补救办法：
1．取下台木，将两边修干
2．调节标本台，使两者平行
3．移动刀片，改用新的刀口
4．待蜡块冷却后再切，或重新包埋
5．用刀片切去部分石蜡，使材料居中
6．在大的一边切去少许石蜡
切片分离、不能连成带状
1．室温过低
2．石蜡过硬
3．材料边缘留蜡太少
4．刀的角度不适合
1．在切片机上方开一电灯或提高室温
2．在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面
3．重新包埋
4．矫正刀的角度
切片卷起呈圆筒状
3．刀口太钝
4．刀的倾角太大
1．提高室温
2．加软蜡
3用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3片即成带
4．减小倾角
切片粘附于切片刀，皱摺在一起
1．室温过高
2．石蜡过软
3．刀口上留有一层石蜡
4．刀口钝
1．降低室温
2．将蜡块投入凉水中稍浸耒—增加
3．切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡
4．磨刀或移动刀口
切片纵裂
1．刀有缺口
2．石蜡块中含有颗粒、杂质
3．刀口留有碎屑或细丝
4．组织太硬
1．可移动刀口
2．将颗粒拽去
3．清洁刀口
4．让包埋块在水中浸泡
切片有横纹
1．刀和台木的固定螺丝太松
2．刀口倾斜度太大
3．刀口有石蜡屑
1．旋紧螺旋
2．可放平1—2。
后再切
3．用氯仿拭去
切片厚薄不匀
1．切片机有毛病
2．夹刀不当
3，未旋紧标本台螺旋
4。
石蜡块过硬
1．矫正切片机装置
2．对症治疗
3．旋紧螺旋
4．将石蜡块在水中浸泡
每张切片厚薄不匀
1．刀口震动，是由于材料过硬
2．刀的倾角太大
1。
在蜡块表面涂一层火棉胶
2．减小倾角
材料发生裂隙破碎或脱落
1．脱水不干净
2．有透明剂残留
3．石蜡透入时，温度过高或时间过长
4．由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆
5．材料太硬或太粗
1．无法弥补
2．增加浸蜡时间，重新包埋
3．无法补救
4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明
5．在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液
切片时发生沙沙声
1．组织块过硬
2．包埋温度过高
3，材料内留有结晶体
1．浸泡水中软化
2．无法补救
石蜡块将蜡带抬起
1．由于摩擦而产生静电荷所致
2．石蜡块上面附有石蜡碎屑
3．刀口上附有石蜡碎屑
2．用刀片将碎屑清除
3．用二甲苯或氧仿清除
7．贴片
切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。
贴片一般有捞片法和烫板法。
捞片法比较简单，首先将切片分割开，投入到48℃的温水浴中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中，去除蛋黄留下蛋白，用筷子充分调打成雪花状泡沫，然后用双层纱布过滤至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存几个月到一年。
）或5％明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥。
烫板法，是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，最后将载玻片再度放烫板上晾干。
要注意，不管是使用捞片法还是烫板法，所用的载玻片必须洁净，不能有油污（检验法：
已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水，若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁，有残留油脂等物在上面）；
切片的光面应朝下，否则染色过程中切片容易脱落。
8．染色
组织切片是无色透明的，必须进行染色后才能观察到各种微细结构。
染色方法很多，但是染色剂往往是水溶液，因此切片必须经过脱蜡而再度复水。
这方法即为脱水、透明的逆过程。
由于切片十分菲薄，处理的时间大大减少，一般每级停留约2～5min。
染色是一个复杂的过程，兼有物理和化学作用，对其中的机制目前了解得不很清楚。
研究细胞器和细胞内的重要组分都有很多现成的方法，例如显示DNA的Feulgen反应，显示RNA的Brachet反应，显示多糖的PAS反应，显示蛋白质的Millon反应和显示某些酶的钙—钴法等，可以根据不同的要求来选用。
9．透明
染色后的切片须再次经过脱水、透明。
标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地显示出来。
10．封藏
封藏的目的是使制成的切片能够永久保存，封藏剂必须能与透明剂互溶，对染色无影响，折射率近似玻璃和具有粘性的物质，常用的封藏剂有加拿大树胶和中性树胶。
封片的方法是：
将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片，避免产生气泡，也不得拖动盖玻片，以免将标本破坏。
树胶量视盖玻片大小而定，勿使过多过少。
贴上标签，注明材料、染色法，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片。
石蜡切片基本步骤之一器材和试剂
一、准备工作
（一）
（一）洗涤实验所需器皿：
（玻璃器皿的清洗）
1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷
2、将器皿在自来水下冲洗干净
3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干
注：
一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。
（二）配制：
硫酸洗液的配制
（三）载玻片与盖玻片的处理
1.将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时
2.流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍
3.95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用
在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、准备工作
（二）常用液体的配制
（一）缓冲溶液：
1．磷酸盐缓冲液
A液：
0.1mol/L磷酸二氢钠
B液：
0.1mol/L磷酸氢二钠
A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：
7≈PH7.0）
2．枸椽酸缓冲溶液
0.1mol/L枸椽酸
0.1mol/L枸椽酸钠
A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：
42.8≈PH6.2）
（二）固定剂：
1．甲醛：
10%甲醛
福尔马林100ml
蒸馏水900ml
实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液
甲醛液10ml
蒸馏水90ml
加碳酸钙至过饱和（以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度）充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：
8%多聚甲醛
多聚甲醛8g
蒸馏水100ml
加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。
滴加1NNaOH，并不停搅动至液体清明。
1NNaOH
lN等于1L溶液中某种物质1mol除以该物质的氢当量价所得数值的量
氧化钠（NaOH）；
分子量＝40．005，当量价＝1
1NNa0H的配制方法为：
m＝40．005／1＝40．005g。
取40．005gNaOH溶解于1L蒸馏水中
4%多聚甲醛
8%多聚甲醛50ml
0.1M磷酸盐缓冲液50ml
PH7.2
先取50ml8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氢钠和0.1M磷酸氢二钠将PH值调至7.2
4．Bouin液：
苦味酸饱和水溶液75ml
36％~40％福尔马林液25ml
冰醋酸5m1
5．改良Bouin氏固定液
苦味酸饱和水溶液45ml
95%酒精45ml
36％~40％福尔马林液5ml
冰醋酸5m1
6．Carnoy液：
冰醋酸10m1
氯仿30m1
无水乙醇60m1
以上三者临用前混合，预冷至4℃后使用。
24小时后固定液失效。
（三）染色液
1．Harris苏木精液
苏木精1g
无水酒精10ml
铵矾或钾矾20g
蒸馏水200ml
氧化汞0.5ml
冰醋酸8ml
将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。
全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96ml中加4ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期1~2个月。
此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。
由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。
2．Mayer苏木精掖
钾矾或铵矾50g
碘酸钠0.2g
蒸馏水1000ml
水合氯醛50g
枸橼酸1g
将苏木精，钾矾及碘酸钠依次加入水内，略加热并搅拌，此时液体呈蓝色，待全溶后过夜。
再加入水合氯醛及枸橼酸并加热至煮沸5分钟，冷后过滤备用。
如不急用可不煮沸而在室温待其成熟，染液可较长期贮存使用。
核染色鲜明，染色时间5—10分钟。
用该染液染色后，不需分化，充分水洗蓝化后即可，伊红复染细胞质，使用一段时间后就要换新溶液。
3．Hasnsen甲矾苏木精的配制
无水乙醇10ml
钾矾20g
C液：
高锰酸钾1g
蒸馏水16ml
三液分别溶化后，将A液倒入B液，再加入C液3ml，充分搅拌均匀后加热至沸腾，1分钟左右，将容器置于冷水中使其迅速冷却，此液配后即可使用，染后无需碱化，细胞核即为蓝色，效果较好，高锰酸钾可以迅速氧化苏木精（每1g苏木精需0.177g高锰酸钾氧化）。
4．伊红
0.5~1%水溶液或酒精溶液。
1．水溶性伊红
伊红5~10g
冰醋酸10滴
先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒搅起泡沫后过滤，再加冰醋酸。
2．醇溶性伊红
70%~90%酒精1000ml
（四）其它
1．麻醉剂：
2~4%戊巴比妥钠，1ml/kg体重（45mg/kg）。
2．各级浓度酒精的配制
75%；
85%；
95%；
100%酒精。
75%和85%酒精用95%酒精配制；
（取75ml95%酒精，加水至95ml，即为75%酒精）
3．盐酸洒精
多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。
配法是在100ml的70％酒精内加0.5~1ml的浓盐酸（Hcl）。
用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。
4．碘酒
取碘5g，溶于95％酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成
5．生理盐水
以氯化纳0.85~0.90g溶于100m1蒸馏水配成的生理盐水适用哺乳动物
石蜡切片基本步骤之二取材固定
三、取材，固定
（一）实验动物的抓取及固定
1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法
要点：
（1）动作要轻缓；
（2）不要突然袭击；
（3）如发现动物的毛发竖起来时，最好停一会后再抓；
（4）将四肢打开，固定在木板或方形蜡板上。
2．实验家兔的抓取及固定方法
（1）随时抚摩其头部；
（2）防止被其脚爪抓伤；
（3）根据实验要求选择固定方法。
3．豚鼠的抓取及固定方法
先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓紧两耳间头颈部的皮肤，用另一只手托起臀部送到动物固定台上。
（二）实验动物的编号、标记、分组和被毛去除方法
1．编号和标记方法
（1）染色法
标记溶液：
3%~5%苦味酸黄色
2%硝酸银咖啡色（涂后光照10分钟）
0.5%中性红或品红红色
龙胆紫紫色
编号原则：
先左后右，从前到后
左前脚为1，左侧腹为2，左后腿为3，头顶为
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