最新蛋白质的一级结构共价结构Word文档下载推荐.docx

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确定亚基种类及数目

多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：

⑴非共价键结合

8mol/L尿素，SDSSDS-PAGE测分子量

⑵二硫键结合

过甲酸氧化：

—S—S—+HCOOOH→SO3H

β巯基乙醇还原：

举例:

：

血红蛋白（α2β2）

（注意，人的血红蛋白α和β的N端相同。

）

分子量：

M

拆亚基：

M1、M2两条带

拆二硫键：

分子量关系：

M=2M1+2M2

测定氨基酸组成

主要是酸水解，同时辅以碱水解。

氨基酸分析仪自动进行。

确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。

①Trp测定

对二甲基氨基苯甲醛590nm。

②Cys测定

5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB，412nm

端基分析

①N端分析

DNS-cl法：

最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。

DNFB法：

Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等

PITC法：

Edman法，逐步切下。

无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。

②C端分析

A．肼解法

H2N-A-B-C-D-COOH无水肼NH2NH2100℃5-10h。

A-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH

氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。

B．羧肽酶法（Pro不能测）

羧肽酶A：

除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a

羧肽酶B：

只水解Arg、Lys

NH2N……………Val—Ser—GlyC

图P118羧肽酶法测C末端

肽链的部分裂解和肽段的分离纯化

化学裂解法

①溴化氰—Met—X—产率85%

②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%

③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—

④羟胺NH2OH—Asn—Gly—

约150个氨基酸出现一次

酶法裂解

①胰蛋白酶LysX

（X≠Pro）

Arg——X

②胰凝乳蛋白酶Tyr——X

（X≠Pro）

Trp——X

Phe——X

胃蛋白酶

Phe（Trp、Try、Leu）——Phe（Trp、Try、Leu）

③Glu蛋白酶Glu——X

（V8蛋白酶）

④Arg蛋白酶Arg——X

⑤Lys蛋白酶X——Lys

⑥Pro蛋白酶Pro——X

肽段的分离纯化

①电泳法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

根据分子量大小分离

②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）

根据肽段的电荷特性分离

③反相ＨＰＬＣ法

根据肽段的极性分离

④凝胶过滤

肽段纯度鉴定

分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－cl法

要求：

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。

肽段的序列测定及肽链的拼接

Edman法

一次水解一个Ｎ端a.a

（1）耦联

PITC＋H２N—A-B-C-D……pH8—9，40℃PTC——A-B-C-D……

（2）裂解

PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸ATZ—A+H2N—B-C-D

（3）转化

ATZ—APTH—A

用GC或HPLC测定PTH-A

PTC肽：

苯氨基硫甲酰肽

ATZ：

噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）

PTH：

苯乙内酰硫脲（一氨基酸）

耦联：

得PTC肽

一次循环裂解：

ATZ- 

a.a

转化：

PTH-a.a

反应产率99％循环次数120

（偶联、降98%60

解两步）90%40

DNS-Edman法

用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。

Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽

图

有色Edman法

荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。

用自动序列分析仪测序

仪器原理：

Edman法，可测60肽。

1967液相测序仪

自旋反应器，适于大肽段。

1971固相测序仪

表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。

1981气相测序仪

用Polybrene反应器。

（聚阳离子）四级铵盐聚合物

液相：

5nmol20-40肽97%

气相：

5pmol60肽98%

肽段拼接成肽链

16肽，Ｎ端HＣ端Ｓ

Ａ法裂解：

ONSPSEOVERLAHOWT

Ｂ法裂解：

SEOWTONVERLAPSHO

重叠法确定序列：

HOWTONSEOVERLAPS

二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定

二硫键的确定（双向电泳法）

碘乙酰胺封闭-SH

胃蛋白酶酶解蛋白质

第一向电泳

过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H

第二向电泳

分离出含二硫键的两条短肽，测序

与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。

酰胺的确定

Asp–Asn、Glu-Gln

酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn

举例：

Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时，电荷量是Leu+Pro0Val-

此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。

糖、脂、磷酸基位置的确定

糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷-0-糖苷

脂类：

Ser、Thr、Cys

磷酸：

Ser、Thr、His

经验性序列：

Lys（Arg）-Ser-Asn-Ser（PO4）

Arg-Thr-Leu-Ser（PO4）

Lys（Arg）–Ala-Ser（PO4）

蛋白质的一级结构与生物功能

蛋白质的一级结构决定高级结构和功能

蛋白质一级结构举例：

（1）牛胰岛素

Sanger于1953年首次完成测序工作。

P128图3-38

分子量：

5700dalton

51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，

A链内有一个二硫键Cys6—Cys11

A.B链间有二个二硫键A.Cys7—BCys7

A.Cys20—BCys19

（2）核糖核酸酶（RNase）

P128图3-39

12600

124个a.a残基

4个链内二硫键。

牛胰RNase变性一复性实验：

P164图3-69。

（8M尿素+β硫基乙醇）变性、失活→透析，透析后构象恢复，

活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。

（3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构

P129图3-40

同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化

同源蛋白质：

在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。

如：

血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。

同源蛋白质的特点：

①多肽链长度相同或相近

②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。

③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。

通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。

细胞色素C

存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。

P130，图3-41

12500左右

氨基酸残基：

100个左右，单链。

25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。

60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。

亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。

亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。

人与黑猩猩0

人与猴1

人与狗10

人与酵母44

胰岛素

祥见P175胰岛素的结构与功能

不同生物的胰岛素a.a序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，

A．B链上6个Cys不变（重要性），其余18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。

其它氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。

蛋白质一级结构的个体差异—分子病

分子病：

基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。

LinusPauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白是由两条相同的α链和两条相同的β链组成α2β2，镰刀形红细胞中，血红蛋白β链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。

因此，当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用（血细胞溶解）导致病血，棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低。

以血红蛋白为例：

α2β2寡聚蛋白

正常人血红蛋白，β.N......Glu6

镰刀型贫血β.N......Val6

生理条件下电荷：

Va10Glu-

疏水亲水

人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Va1分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。

一级结构的部分切除与蛋白质的激活

一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。

血液凝固的机理

凝血因子（凝血酶原致活因子）

凝血酶原凝血酶

纤维蛋白原A纤维蛋白B凝胶

（1）、凝血酶原

P133图3-43凝血酶原的结构

糖蛋白，分子量66000，582个a.a残基，单链。

在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275和Arg323—Ile324断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶。

A链49a.a

B链259a.a

（2）、

纤维蛋白原

P133图3-44纤维蛋白原的结构

α2β2r2

α肽：

600个氨基酸，β肽：

461氨基酸，r肽：

410个氨基酸

在凝血酶作用下，从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。

P133纤维肽A.B的结构

A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。

P134上

在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。

胰岛素原的激活

P134图3-45

胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。

前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。

并在特异的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰岛素。

多肽与蛋白质的人工合成

在医药和研究方面意义重大

1958年，北大生物系合成催产素8肽。

1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。

1969年，美国Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰RNase（124aa—）。

P139图3-46多肽的固相合成

C端N端。

挂接→去保护→中和→缩合→去保护→中和→缩合

蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质

二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。

肽链的构象

多肽链的共价主链上所有的α--碳原子都参与形成单键，因此，从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。

但是，目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳定，这种构象称天然构象，此时蛋白质具有生物活性，这一事实说明：

天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转。

肽链的二面角

P143图3-51、图3-52

多肽主链上只有α碳原子连接的两个键（Cα—N1和Cα-C2）是单键，能自由旋转。

环绕Cα—N键旋转的角度为Φ

环绕Cα—C2键旋转的角度称Ψ

多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角来描述，称二面角。

当Φ的旋转键Cα-N1两侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时，规定Φ=0°

。

当Ψ的旋转键Cα-C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时，规定Ψ=0°

从Cα向N1看，顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值，反之为负值。

从Cα向C2看，顺时针旋转Cα-C2键形成的Ψ角为正值，反之为负值。

多肽链折叠的空间限制

Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。

因此二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。

Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ

P144表3-12蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。

拉氏构象图：

Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。

P145拉氏构象图（Gly除外）

⑴实线封闭区域

一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。

⑵虚线封闭区域

是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。

⑶虚线外区域

是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。

Gly的Φ、Ψ角允许范围很大。

总之，由于原子基因之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的，对非Gly氨基酸残基一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％。

二级结构的基本类型

驱使蛋白质折叠的主要动力：

（1）暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。

（2）要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。

α螺旋

（3）、α螺旋及其特征

在α螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。

典型的α螺旋有如下特征：

①二面角：

Φ=-57°

Ψ=-48°

，是一种右手螺旋

回忆P143图3-52

②每圈螺旋：

3.6个a.a残基，高度：

0.54nm

③每个残基绕轴旋转100°

，沿轴上升0.15nm

④氨基酸残基侧链向外

⑤相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。

⑥肽键上N-H氢与它后面（N端）第四个残基上的C=0氧间形成氢键。

这种典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括13个原子。

2.27螺旋（n=1）

310螺旋（n=2，Φ=-49°

Ψ=-26°

613螺旋（n=3）

4.316螺旋（n=4）

封闭环原子数3n+4（n=1、2、.....）

2.273103.6134.316

n=1n=2n=3n=4

α-螺旋π-螺旋

（4）、R侧链对α—螺旋的影响

R侧链的大小和带电性决定了能否形成α—螺旋以及形成的α—螺旋的稳定性。

①多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,（如Lys，或Asp，或Glu），则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的α—螺旋。

如多聚Lys、多聚Glu。

而当这些残基分散存在时，不影响α—螺旋稳定。

②Gly的Φ角和Ψ角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成α—螺旋所需的二面角的机率很小，不易形成α—螺旋。

丝心蛋白含50%Gly，不形成α—螺旋。

③R基大（如Ile）不易形成α—螺旋

④Pro、脯氨酸中止α—螺旋。

⑤R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。

如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。

（5）、pH对α—螺旋的影响

多聚L-Glu和多聚L-Lys

P149图3-57

（6）、右手α-螺旋与左手α-螺旋

图P148

右手螺旋比左手螺旋稳定。

蛋白质中的α—螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°

、Ψ+42°

）。

（7）、α-螺旋结构的旋光性

由于α-螺旋结构是一种不对称的分子结构，因而具有旋光性，原因：

（1）α碳原子的不对称性，

（2）构象本身的不对称性。

天然α—螺旋能引起偏振光右旋，利用α—螺旋的旋光性，可测定蛋白质或多肽中α—螺旋的相对含量，也可用于研究影响α—螺旋与无规卷曲这两种构象之间互变的因素。

α-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。

（8）、α-螺旋（包括其它二级结构）形成中的协同性

一旦形成一圈α-螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而迅速。

β-折叠

P149图3—58P150图3—59

两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。

β-折叠中所有的肽链都参于链间氢键的形成，氢键与肽链的长轴接近垂直。

多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。

平行式：

所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。

反平行式：

肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同

φ=-119°

Ψ=+113°

φ=-139°

Ψ=+135°

从能量上看，反平β-折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH---O几乎在一条直线上，此时氢键最强。

在纤维状蛋白质中β-折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。

在纤维状蛋白质的β-折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，β-折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。

β-转角（β-turn）

β-转角也称β-回折（reverseturn）、β-弯曲（β-bend）、发夹结构（hair-pinstructure）

β-转角是球状蛋白质分子中出现的180°

回折，有人称之为发夹结构，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。

目前发现的β转角多数在球状蛋白质分子表面，β转角在球状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的1/4。

β转角的特征：

①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。

②主链骨架以180°

返回折叠。

③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键

④C1α与C4α之间距离小于0.7nm

⑤多数由亲水氨基酸残基组成。

无规卷曲

没有规律的多肽链主链骨架构象。

球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。

α-螺旋，β-转角，β-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。

超二级结构

由若干个相邻的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。

αα结构（复绕α-螺旋）

由两股或三股右手α-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋，重复距离140A。

p153图3-61A

存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。

βxβ结构

两段平行式的β-链（或单股的β-折叠）通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二级结构。

①βcβ

x为无规卷曲

p153图3-61B

②βαβ

x为α-螺旋，最常见的是βαβαβ，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。

p153图3-61C

β曲折（β-meander）

由三条（以上）相邻的反平行式的β-折叠链通过紧凑的β-转角连接而形成的超二级结构。

P153图3-61D

回形拓扑结构（希腊钥匙）

P153图3-61E

β-折叠桶

由多条β-折叠股构成的β-折叠层，卷成一个筒状结构，筒上β折叠可以是平行的或反平行的，一般由5-15条β-折叠股组成。

超氧化物歧化酶的β-折叠筒由8条β-折叠股组成。

筒中心由疏水氨基酸残基组成。

α-螺旋-β转角-α-螺旋

两个α-螺旋通过一个β转角连接在一起。

λ噬菌体的λ阻遏蛋白含此结构。

在蛋白质与DNA的相互作用中，此种结构占有极为重要的地位。

纤维状蛋白质

纤维状蛋白质的氨基酸序列很有规律，它们形成比较单一的、有规律的二级结构，结果整个分子形成有规律的线形结构，呈现纤维状或细棒状，分子轴比（轴比：

长轴/短轴）大于10，轴比小于10是的球状蛋白质。

广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，占脊椎动物体内蛋白质总量的50%以上，起支架和保护作用。

角蛋白

源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物（发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝）可分为α-角蛋白和β角蛋白。

（9）、α-角蛋白

P155图3-63，P156图3-64

主要由α-螺旋结构组成，三股右手α-螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤微

结构稳定性由二硫键保证，α-角蛋白在湿热条件下可伸展转变成β-构象，烫发的化学机理Cys含量较高。

？

α-角蛋白（α-Kerati