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\u0010~-]\u0006b\u0008l\u001CM1M\u0019Y"

p\u000Eo0我的研究--首页!

K\u001Fz$Y\u0008H\u0008h\u0004}*P5x

二、体外抗肿瘤活性试验

\u0007z\u0018?

\u0007S\u0013e\u000Enk\u0001{,L01.试验目的

'

L^+_/r.I(v6L01.1对候选化合物进行初步筛选;

l\u0019S'

n\u000E@3{\u0018S&

{\u0015`b#E01.2了解候选化合物的抗瘤谱;

+J1Z\u0016?

\u0010g\u0018sg/z+J01.3为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考,如剂量范围、肿瘤类别等。

2I2bT\u0018?

\u0011~\u0001d\u0012s0我的研究--首页'

@*j\u0012Z\u0007@(G1[7?

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d(S\u0006K\u001D~\u0004y

2.试验方法

"

z7D\u0015Y\u0005N,M"

U0选用10-15株人癌细胞株,根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度,按常规细胞培养法进行培养;

推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT还原法、磺酰罗丹明B染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。

药物与细胞共培养时间一般为48-72小时,贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药。

试验应设阳性及阴性对照组,阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药,阴性对照为溶媒对照。

我的研究--首页I\u001AD;

d7O\u0017}\u0006S*f-V"

R

\u0002Z\u0019C1_\u0019a\u000E|q\u0006z\u0016d03.评价标准我的研究--首页5E%T/Wm\u0005i9b

以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线,然后采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。

体外试验至少重复一次。

我的研究--首页(b\u001DoW\u0010{\u0002z\u0014p\u0001@\u0014n\u000Fg

我的研究--首页)Ai7i6P\u001DP\u000Fai\u0012e'

G

附注:

评价药物抗癌活性的方法:

我的研究--首页/s\u0019^\u001A_(k(|'

P1U\u0005|

1.MTT还原法我的研究--首页\u0005@\u0015M6H\u0003[)r5u\u0003E9^

1.1基本原理:

我的研究--首页\u0016w4T\u0004S\u000FG\u0011Kg\u0017|\u0007u\u0013w\u0015T\u001F_

四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide]是一种能接受氢原子的染料。

活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替](formazan),而死的细胞则无此功能。

用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后,在一定波长下用酶标仪测定光密度值,即可定量测出细胞的存活率。

-C&

O$P;

a\u0014O6d+b01.2操作步骤:

6A\u0011q2~/S:

A01.2.1选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞,用胰酶消化后,用含10%小牛血清的RPMIl640培养基配成5000个/ml的细胞悬液,接种在96孔培养板中,每孔接种200μl,37℃,5%CO2培养24h。

f)q\u000Fk/|3R2lx01.2.2实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基,对照组则换含等体积溶剂的培养基,每组设3~5平行孔,37℃,5%CO2培养4~5d。

e6`\u001DA!

i-f\u000EV01.2.3弃去上清液,每孔加入200μl新鲜配制的含0.2mg/mlMTT的无血清培养基.37℃继续培养4h。

小心弃上清,并加入200μlDMSO,用微型超声振荡器混匀后,在酶标仪上以试验波长为570nm,参比波长为450nm测定光密度值。

我的研究--首页#\\u0016[D5s!

w\u0016M\u0017e

1.3结果评定:

我的研究--首页\u0004{D\u001DB\u0003o#QX\u0016q\u0013V$n

按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率:

我的研究--首页8x\u0017x\u0018{.A*[.I\u0006H8N

肿瘤细胞生长抑制率%=(1-OD实验/OD对照)×

100%我的研究--首页G*G)|\u0017k3|#c\u000Ef

以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线,从中求出样品的半数杀伤浓度IC50。

合成化合物或植物提取纯品的IC50<10μg/m1或植物粗提物的IC50<20μg/m1时,则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。

(p)F+Q*W8O"

lv"

y5f0

0A"

q\u0014u\u0015]\u0017f\u0015gR%?

02.生长曲线法的基本原理:

我的研究--首页6S\u001D~\u001Fz\u0007I\u0018v\u0006A\u0008v

在最适条件下,肿瘤细胞在培养液中呈指数生长,如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线,故称此时为对数生长期。

随着细胞密度不断增高,由于代谢产物的积聚及营养物的消耗,细胞生长逐渐减慢以致停止,此时称高坪期或稳定期。

因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。

我的研究--首页*J\u001Ac`;

l;

C3^\u0018~8b

我的研究--首页\u0003o\u0003J5A\u0012E\u0014~

3.染料排斥试验的基本原理:

我的研究--首页\u0012t;

h\u001EL(T'

pq|&

E

活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力,而死细胞由于膜完整性的破坏,可被着色。

因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料,一定时间后,对着色和未着色的细胞进行计数,即可算出被杀死的细胞比例。

我的研究--首页\u0012x\u0012?

\u001Dy\u000Ec\u0012Z\u0005I\u0019y

我的研究--首页7G\u0016B\u0016S:

Z\u0015P\u0006T$A7O\u001Bq

4.集落形成法的基本原理:

\u0014^&

~!

_\u0015V#U\u0005y\0克隆原细胞具有持续增殖能力,当单个细胞分裂6代或6代以上时,其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。

通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。

它反映了单个细胞的增殖潜力,故能较灵敏地测定抗癌药的活性,日前被认为是一种较理想的检测方法。

常用的集落形成法可分为贴壁法及半固体培养法两种。

我的研究--首页8I(di\u0017n9]\u0012j$U\u0017]4u\u0005I\u001FX

我的研究--首页\u0013?

\u0018Y/o\u0007l4o*U\u0015b\u0018F

5.SRB法的基本原理:

我的研究--首页\u0004}\u001E}8^\u0013}2}+DN

SRB(sulforhodamine是一种蛋白质结合染料,粉红色,可溶于水。

SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。

其在515nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。

故可用作细胞数的定量。

MTT法的一个缺点是OD值可随放置时间而变,而SRB法无此现象。

因此更适用于进行大规模的试验。

#F%n\u000FhR\u0017~9Q0三、体内抗肿瘤试验我的研究--首页\u0001zN(s%?

\u0018|

体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型,其中至少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。

试验结果三种模型均为有效,再重复一次也为有效,评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用。

\u0001e\u0005M\u0018`2b\u0013G'

R1`;

p0鼓励使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型、原位接种模型和中空纤维测定(hollow-fiberassay)等方法。

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/X0Tg\u0016}L2W0我的研究--首页\u0006n\u0014H"

h,M\u0008L\u0004|\u001Fb\u0010l\u0015Y

1.动物

u\u0003c6_\u000F{\u0017U\u0016zU0动物要求健康,符合等级动物要求,有实验动物合格证。

雌雄均可,但同一批实验中动物性别必须相同。

小鼠鼠龄为5-6周,体重为18-22克。

评价同一物质的活性时,不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠。

我的研究--首页\u0008r\u0008L\u000FX\u0016@\u000Es\u0010Q#y\u0012g\u0004~\u0001V

我的研究--首页"

i\u0002N\u001Av\u001BQ?

\u0016~(J\u0001}0S

2.肿瘤模型我的研究--首页9y\u000Fk\u0015\\u0007w.o\u0017J\u0008m

2.1小鼠肿瘤模型我的研究--首页\u001CO\u000EZ#M\u0002]+L*Z\u0014P$e

淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤(EAC)、肉瘤-180等,以及各种小鼠肿瘤的亚型和耐药株等。

\u0001FW*O$Q\u001Aa\u0016A0

D2R\u0004D\u001Bp\u0008h\u001AP\u000FV(Mk02.2人癌裸小鼠移植瘤模型

#|+UW;

f/x3B$L\u0019[\u0001F\u0004V0应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。

模型建立和使用应注意:

我的研究--首页)k3P#q"

h8E\u001Af\u001ADs2Fo

(1)移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立,对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解。

\u0014w\u0016P\u0007X&

g\u000FN\u001BJ*X0

(2)移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。

\u0007J\u0013c!

[y5z1P"

v,O\u0013t0(3)对模型生长情况应全面了解,尤其是生长快的模型我的研究--首页\u001BA\u001FG\u0002A&

|]\u0013u,G"

@\u0018h\u0003f

(4)为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性,复苏后移植瘤体内传代应少于15-20代我的研究--首页\u001AR\u0013{3P\u0018D\u0011P

)u$f\u0012j\u001D|"

eU03.试验过程我的研究--首页\u001CK,I\u0016X\u0001Q1g\u0007e\u0018q\u001D{

3.1接种:

我的研究--首页#\\u001Fhd\u0012T5]\u0008_

肿瘤接种方法主要有皮下接种、腹腔接种和原位接种。

我的研究--首页\u0001^\u0005I\u0012o\u0012?

4~3|(j\u0015t\u000Fc

3.1.1皮下肿瘤模型

\u0015T\u0001T\u0015G"

s\u0001P+w\u000FM0选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠,颈椎脱臼处死,在无菌条件下(超净台或接种罩),用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤,切开皮肤,剥离肿瘤。

将瘤组织剪成1.5mm3左右,用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下;

或制成细胞悬液,然后按一定比例加入无菌生理盐水,一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为(1-5)×

106。

我的研究--首页*H\u0012z\u0018O9n\u0011a#f7NhK5A9~$z3_

)W\u0016j'

c'

E.}\u001A|,x03.1.2腹水瘤模型我的研究--首页Z\u001BF5T\u0018N~

无菌条件下,消毒动物皮肤,吸取生长良好的动物腹水,以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔,接种细胞数量一般为(1-5)×

8V\u001EC\u0012WBJ0d\u0012s*~0

3J\u0012fL)K%X\u0017r\u0007?

6P\u0016Z)]-`\u0012_03.1.3原位接种模型

3\\u0013g4q){.[/E\u0002?

Q9X0原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器,如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。

原位接种不是常规的方法,但有其优越性,是鼓励使用的方法。

主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法。

\u0004G#^!

X\u0002m,x\u0007M0

e*D\u0007{\u001Da%e8?

03.2动物分组我的研究--首页+X,T9_+n\u0007m\u001Fx%A\u000E}9G

3.2.1试验设阴性对照组、阳性对照组、治疗组。

h-t\u001Dy6Z\u0018O#B03.2.2治疗组设高、中、低三个剂量组。

小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组,裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径,待肿瘤生长至100—300mm3后将动物随机分组。

我的研究--首页\u0008{,V\u001B^\u0004?

\u001Fk;

B'

V\u0008K

3.2.3动物数普通小鼠每组10只,裸鼠6只。

阴性对照组动物数为治疗组动物数×

实验组数1/2

x\u0015p\u001B_R\u0007V\u000EMG\u0019A\u0003Hx0我的研究--首页"

b\u0016}*])y\u0018C\u0012I7f

3.3剂量设置

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S\u000EO\u0015N9m\u000Eq$?

F3M03.3.1治疗组设高、中、低剂量治疗组,一般按4:

2:

1设置,高剂量使用最大耐受量或LD10的剂量。

我的研究--首页o\u001CX\u0008r\u0017p3j\u0015e#|J

3.3.2阴性对照组给予相应的溶剂;

\u001DH%@6t\u001D_#^\u000EBw2j03.3.3阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物,

Ce;

W\u0008`q2V#\\u0005f$f03.3.4如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时,必须选用该抗癌药物作为阳性对照药。

我的研究--首页:

i;

E,q0a0y/F\u0019h

我的研究--首页;

f\u0019ji\u0008L\u0017A_\u0010^

3.4阳性对照药选择原则

+H#Xy&

O\u0007j\u0018ba\u0015W0疗效确切;

与被试物质化学结构类似;

与被试物质有类似的作用机理。

我的研究--首页\u0002g%T\u0016u\u001AWN\u001Cx(F

我的研究--首页3p\u001EY\u0017v3Q\u0013J

3.5药物配制

\u0018_\u001Bf\u0011x\u0017Td\u0014t-~0溶于水的药物,用生理盐水或蒸馏水配制;

如用酸、碱溶解者,可先用小量酸(0.1-0.5NHCl)或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解,调节pH在4.5-9.0的范围内。

用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物,或用吐温60、吐温80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物,可腹腔注射或口服,但必须设相同浓度的溶剂对照组。

用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射。

我的研究--首页\u001Ez\u0005Y\u001F[!

h\u0006n\u0019z\u001AS"

q\u0008d

我的研究--首页*Z4X\u001AA8}\u001Cj\u001AR\u0004Ot\u0004X\u001Ba\u001D_

3.6给药方案和给药途径我的研究--首页:

O\u0019}2R*{X8B"

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[!

N

分组当日开始给药,根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。

给药途径应与推荐临床用药的途径相同。

给药次数较多,或被试物质溶解性较差,静脉给药有困难时,可考虑使用腹腔给药,但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的。

可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。

腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。

UR\u001Bx0|?

6X\u001DH3X\u001AX:

[0

5i'

W\u0017A\u0010LU\u0019Y\u0015}04评价标准我的研究--首页6Q1J\u0006R\u001DQ:

^,x8w*s\u0018g\u0019j^

4.1腹水瘤模型

u\u0008dUo\u001Eq0接种给药后,观察和记录动物死亡时间,计算生存天数。

如阴性对照组20%动物存活时间超过4周,表明腹水瘤生长不良,实验作废。

我的研究--首页\u001A~\u0014e$i(M*A\u001Cq

采用中位生存时间(即mediansurvivaltime,MST)来评价每组的生存时间,其计算公式为:

我的研究--首页\u000Ec-VI\u001FA&

u*|\u0004G;

l

#A'

d1g\u001FB4Gh\u0005q\u000EA\u001FX0每组鼠数的中间数-中间生存天数前死亡的鼠数

\\u0017K.k\u0015H\u0001i\u0019s\u0019R0MST=(中间生存天数-0.5)+

G0y4^D7_4K0@\u0005|r'

~0中间生存天数死亡的鼠数

U*G\u001EI"

H*{$`L7U0

!

{\u0004X*[\u0008Lk\u000E`4l\u0002B1`\u0006e\u0012l0治疗组与对照组的比较,采用T/C(%)来表示,计算公式为:

我的研究--首页+B\u0017x4q\u0012W\u0002z\u000FY+Z

TMST我的研究--首页:

m;

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Q\u0002`6`\u001At+F

T/C%=────×

100%

*}_\u0007I\u001BV\u0002i\u001B|#~\u0003\\u0007|\u0005W\u001AA&

g0CMST我的研究--首页)~\u0005g\u0003]\u0002v/\\u0012p\u001FG

TMST:

治疗组MST;

CMST:

阴性对照组MST。

7h)i$V[,E\u0002o\u0006t:

Z\u0007w&

i\u0002|0评价标准以125%为界,当T/C%≥125%时。

视为有效,反之则无效。

2XV$e\u000EG\u0001T"

x0

\u0014b\u001EN\u0001S"

[\u0016F\u0018Q04.2裸鼠移植瘤模型

*|\u001Cu\u001DB*c\u001CJF?

\u0006^1y&

Y0S0推荐使用测量瘤径的方法,动态观察受试物抗肿瘤的效应。

肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定,一般为每周2-3次,每次测量同时还需称鼠重。

我的研究--首页\u0004M\u000E{*]\u0010b+O#v

肿瘤体积(tumorvolume,TV)的计算公式为:

z\u0006t"

n\u0003]\u0015L6h\u0005U\u0014i0V=1/2×

b2或π/6×

c我的研究--首页%Y6z0j(Y\u0010c\u000E_A+G;

i*d$Y

其中a、b、c分别表示长宽高。

两公式的相关性极好,可采用任一公式。

\u0012U:

_-R7r\u0003UK$\9a0根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume,RTV),RTV=Vt/V0。

其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积,Vt为每一次测量时

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