固定化技术应用Word文档下载推荐.docx

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经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方而发挥了重要作用。

固定化酶技术的发展

以前，固立化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固立在载体上。

1916年Nelson和Grlmn最先发现了酶的固圧化现象。

科学家们就开始了同定化酶的研究工作。

1969年日本一家制药公司第一次将固泄化的酰化氨基酸水解酚用于从混合氨基酸中生产L一氮基酸，开辟了固左化酶在工业生产中的新纪兀O

我国的固龙化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。

当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。

邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附一交联法，制备岀具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶（MIE）一方面由于载体具有两亲性，MIE可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；

期一方而，由于载体具有磁响应性，MIE又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。

Puleo等将钛合金表而用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表而，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酊处理，再用含碳硝化甘汕接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。

现阶段固左化齣技术存在的缺点

（1）一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。

（2）固泄化酶一般只适用于水溶性的小分子底物：

大分子底物常受载体阻拦，不易接触酶，致使催化活力难以发挥。

（3）首次使用时投入成本较高。

教材上说酶的固泄方法主要有四类，即吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。

1.共价偶联法

共价偶联法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固肚化方法。

酶中的氨基、按基、競基、羟基、咪卩坐基、□引喙基、苯环等常与载体共价结合但必须注意，参加共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性非必需基团，如若共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。

吸附法和共价偶联法又可统称为载体结合法。

2.交联法一戊二醛

是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固怎化方法。

其中使用最广泛的是戊二醛。

戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生反应，从而使酶分子之间相互交联形成固立化酶。

但是，交联法中酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。

3.吸附法

利用载体和细胞表面所带电荷的静电引力（vanderWallsforces）,使细胞吸附于载体上。

吸附法可分为物理吸附和离子吸附两种。

该法操作简单，固立化过程对细胞活性影响小。

①物理吸附法

将酶吸附到固体吸附剂表而的方法，对蛋白质有髙度的吸附能力、又不引起酶变性且能保持一左酶活性。

如：

活性碳、多孔玻璃、石英砂、有机硅等酶固体吸附剂。

②离子交换法

利用蛋白质的两性性质，使其带有电荷的基团与藹子交换剂形成离子键，而被交换结合在交换剂上酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，所以使用受到限制。

4.包埋法

包括凝胶包埋法和微胶囊包埋法，将酶包裹在多孔的载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型，包埋法的酶催化的底物一般是小分子物质。

包埋法是细胞固定化最常用的方法。

包埋法可以分为：

（1）微胶囊法：

利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊。

（2）

凝胶包埋法：

是在无菌条件下，将生物细胞和胶溶液混合在一起，然后再经过相应的造粒处理，形成直径为l-4mm的胶粒。

维.三醋酸纤维、明胶等。

包埋法

来自美国MIT波士顿儿童医院以及其他研究单位的研究人员提出了一种新的胰岛细胞移植方法。

他们设计了一种新型材料能够在进行胰岛细胞移植之前将细胞包裹起来，研究人员在小鼠模型上进行了实验检测，结果表明这些胶囊化的人类细胞能够治疗糖尿病，并且效果长达六个月，同时不会引起机体产生免疫应答。

以前，许多科学家认为用健康胰岛细胞替换病人胰腺内被损伤的胰岛细胞是一种更好的治疗方法，健康胰岛细胞可以对血糖进行合理调节并释放胰岛素。

这种方法已经用于一些病人，但是目前存在的主要问题在于病人的免疫系统会继续攻击移植细胞’因此病人需要长期服用免疫抑制药物。

对于患有I型糖尿病的病人来说，他们的免疫系统会攻击胰腺，最终导致病人失去血糖调节能力。

这些病人必须经常关注他们的血糖水平，有时一天需要进行几次测量，通过注射胰岛素将血糖控制在健康范围。

但是目前很难做到精准的血糖调控，糖尿病病人需要而临长期治疗的难题。

胶囊化胰岛细胞的模型:

Immune

言养谕入：

危的确f臥气，送m质許

NutritionalInpuls:

Glucose..Q,Proteins,Others

:

台疗拎出・

半渗透细胞保护膜漁索.淀粉.湊再他臓等SemiPermeableCellIhcrapeuticOutpuis:

ContainiinentBarrierInsulin,amylln,glu<

agon,other

Ceiln^erapy（eg.PEC-01）

从上世纪80年代开始，注射基因工程细菌合成的胰岛素逐渐成为糖尿病治疗的标准治疗方法。

这种方法虽然有效，但是需要病人付出更多努力，同时还会造成血糖波动。

Anderson以及他的同事几年之前就开始研发将胶囊化胰岛细胞移植变成一种切实可行的糖尿病治疗策略的方法。

他们在开始的时候使用了褐藻胶（来自于褐藻的一种材料）的化学衍生物，利用化学衍生物制成胶用来包裹细胞不会对细胞造成损伤，同时糖和蛋白等分子也可以出入，保证包裹的细胞能够感知并应答生物信号。

但是之前有研究表明将褐藻胶胶囊植入灵长类动物和人类体内，最终会在胶囊周国形成疤痕组织使其失效。

于是研究人员决定对褐藻胶进行修饰降低免疫系统产生的应答。

随后他们在褐藻胶的聚合物链上连接了各种小分子制成不同衍生物，希望这些小分子修饰能够让褐藻胶不被免疫系统识别。

研究人员构建了一个包含大约800个褐藤胶衍生物的化合物库，利用这一化合物库他们在小鼠和非人灵长类动物体内进行了几轮筛选检测。

其中效果最好的是一个叫做TMTD的衍生物，研究人员决泄在糖尿病模型小鼠上进行进一步研究。

他们选择了一个免疫系统活性很强的小鼠品系，将TMTD包裹的人类胰岛细胞移植到小鼠的腹腔内。

移植之后，细胞会立即产生胰岛素应答血糖变化，研究结果显示胶囊化胰岛细胞对血糖的有效控制可以达到174天。

拓展酵母细胞固立化

实验设计

（一）制备固定化酵母细胞

发酵操作流程

酵母细胞的（蛍政►配制CaCb溶液一＞配制海藻酸钠溶液

I

将海藻酸钠溶液与酵母细

胞的混合

酒精发酵冲洗凝胶珠—固定化酵母细胞

试题：

请回答与“固定化酶”实验有关的问题：

（1）«

一淀粉酶可以通过培养枯草杆菌来生产，是筛选

髙表达量菌株的最简便方法之一。

筛选岀的菌株在发酵生产之前还需利

用培养基进行扩大培养。

（2）利用物理或化学的方法将u—淀粉酶固定后，成

为且又有酶活性的制剂。

若用吸附法固定时，在

装柱后需要用缓慢冲洗，直至流出液不使淀粉一碘混合液

发生为止。

（3）将淀粉溶液以一泄流速从反应柱上端滴入，再在下端接取少量流出液进行KI-I：

颜色测试，结果不呈现红色。

对此现象的解释错误的是（A.反应柱中没有a—淀粉酶被固定B.流速过快

淀粉未被水解C.接取的流出液是蒸馀水D.流速过慢淀粉被水解成匍萄糖）

答案：

（1）单菌落分离液体

（2）不溶于水10倍体积蒸饰

水褪色（3）D

解析：

（1）单菌落分离是消除杂菌污染的通用方法，也是筛选高表达量菌株的最简便方法之一。

通常使用液体培养基对微生物菌种进行扩大培养。

（2）利用物理或化学的方法将u—淀粉酶固立后，成为不溶于水且又有酶活性的制剂，这就是固圧化酶。

若用吸附法固立时，在装柱后需要用10倍体积蒸锚水缓慢冲洗，直至流岀液不使淀粉一碘混合液发生蓝色褪色为止，因为淀粉的水解产物不能使碘液呈现蓝色，如此说明流出液中没有了a一淀粉酶。

（3）淀粉水解产生的糊精会使KI一12呈现红色，若不岀现红色说明流出液中没有糊精，可能的原因是反应柱中没有a—淀粉酶，或流速过快淀粉未被水解，或接取的流出液是蒸馅水，但流速过慢淀粉被水解成匍萄糖是错的，因为一淀粉酶不会使淀粉水解成葡萄糖，D错误。

1.果胶是植物细胞壁的主要成分,由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成，果胶酶和果胶甲酯酶可以水解果胶。

要使果汁澄淸，需要同时使用两种酶。

鉴别果胶的一种简易方法是果胶不溶于乙醇,如果果汁中含有比较多的果胶，加入95%乙醇后会出现絮状沉淀。

实验表明，果汁制作时，使用果胶酶和对果汁加热有利于提高岀汁率和澄淸度。

2.固左化酶是将水溶性的酶用物理或化学的方法固左在某种介质上,使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

3.固泄化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。

教材中用吸附法法将a—淀粉酶固左在右英砂上。

4.淀粉以较慢的流速过柱，使底物和酶充分接触,使反应充分,在流岀液中加入淀粉指示剂（即KI—"

溶液）,用生稀释1倍后再观察颜.

鱼，若出现红色,则说明淀粉在（】一淀粉酶作用下被水解成糊精。