酶学课件复习资料解析.docx

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酶学课件复习资料解析

食品酶学的涵义

●酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊蛋白质

●酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。

酶的蛋白质本质

二、酶的一级结构与催化功能的关系

●酶的一级结构即酶的化学结构，主要包括组成蛋白质的氨基酸的种类，数目，排列次序，二硫键的数目和位置，肽键的数目等；是酶的空间结构的基础。

●决定酶的空间结构的因素，主要是由酶的一级结构所决定的各种侧链之间的相互作用。

●此外，也受各种环境因素，如：

溶剂、PH值、温度、离子强度等的影响。

§酶的一级结构的改变主要是指酶分子主链的断裂。

酶分子的主链包括肽链和核苷酸链。

三、酶的二、三级结构与催化功能的关系

●酶的二、三级结构是所有酶都具有的基本空间结构。

完整的二、三级结构对维持酶的活性中心的空间构象至关重要。

●酶的二、三级结构的破坏将使酶的催化活性丧失。

四、酶的四级结构与催化功能的关系：

●酶的四级结构是由多个亚基联结而成。

●具有四级结构的酶中有些仅仅具有催化作用，主要是多催化部位寡聚酶和多酶复合体。

●有些具有催化部位和调节部位，具有催化和调节两种作用，主要是别构酶。

1、四级结构与催化作用的关系

●多催化部位寡聚酶由若干个相同的亚基组成，四级结构完整时，酶的催化功能才能充分发挥出来。

●当四级结构受到破坏，亚基便分离，一般情况下酶便失去活性，若采用适当的分离方法，被分离的亚基仍然具有催化活性。

●多酶复合体的四级结构受到破坏时，亚基的活性减弱或消失。

2、四级结构与调节作用的关系：

别构酶只有在四级结构完整时才显示其调节作用，分开的调节亚基不具有调节功能。

五、辅助因子与催化功能的关系（辅助因子分为无机辅助因子和有机辅助因子）………………………………不考问答

1、无机辅助因子与催化功能的关系，无机辅助因子主要是各种金属离子，与催化功能的关系有如下几个方面：

（1）金属离子可以与底物形成三元复合物，使底物趋近酶分子，并促使酶的活性中心与底物之间的反应基团具有正确的空间走向；

（2）金属离子具有亲电性质，可以促使酶与底物之间的亲电攻击，使反应加速进行；

（3）金属离子具有稳定酶分子空间构象的作用，使酶保持其稳定的催化功能；

（4）金属离子可以作为电子传递体，参与酶的氧化还原反应

2、有机辅助因子与催化功能的关系：

●有机辅助因子主要是各种小分子有机化合物。

●在酶的催化过程中，主要起各种基团的传递作用，使催化反应能够迅速进行。

酶的活性部位

（一）活性部位的概念

酶分子的活性部位或活性中心：

指酶分子中能直接结合底物，并催化底物发生反应的部位。

●活性部位位于酶分子表面的疏水裂隙内，酶分子的构象决定活性部位的构象。

（二）结合部位和催化部位活性部位可分为结合部位和催化部位

1、结合部位：

与底物分子直接结合，负责酶的专一性；结合部位通常由几个氨基酸残基组成，有的还包含金属离子。

结合部位有特定的空间排布和一定的柔性

2、催化部位：

是指酶分子上直接催化底物发生反应的部位，决定着酶催化能力的大小

酶作用专一性机理

（一）酶作用专一性：

是指酶对底物和所催化的反应有选择性。

绝对专一性：

有少数的酶，对底物结构的要求很严格，只作用于一种底物。

相对专一性：

大多数的酶可以作用于一些或一类结构相近的底物。

立体专一性：

几乎所有的酶都具有立体专一性，是指酶只能作用于底物的立体异构体中的一种。

（二）酶作用专一性机理

诱导契合学说：

在酶与底物结合的过程中，酶分子构象发生变化，底物分子的构象亦发生相应变化之后，才互补结合的。

这种酶与底物互相变化而彼此适应的过程，称为诱导契合学说。

结合专一性：

即底物专一性，取决于酶的活性部位（主要是结合部位），酶的活性部位有一定的大小和形状，它决定着底物分子能否与酶的活性部位镶嵌互补，结合部位的几个结合基团能否与底物分子相应基团相结合。

催化专一性：

即反应专一性，决定于酶催化部位的结构；底物必须有能被酶作用的敏感键或敏感基团；底物敏感键的相对位置必须与催化基团配合恰当；酶反应所经历的几个中间步骤中，每一步可能由不同的催化基团催化，因此，所有的催化基团都必须与底物适当配合，这就产生了催化专一性。

酶的高效催化机理

活化自由能：

反应系统中加入催化剂，能使活化能降低，使分子较易克服能障。

第五节酶的生产方法

利用微生物产酶的优点：

1、微生物种类多，酶种多，且菌株易诱变，菌种多样；

2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶；

3、微生物培养基来源广泛，价格便宜；

4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高；

5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术，选育菌种，增加酶产率和开发新菌种。

微生物法生产酶的一般原理和工艺

一、酶的生产菌种

1、产酶菌种的要求：

（1）不是致病菌，在系统发育上最好是与病原体无关；

（2）能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高；

（3）菌种不易变异退化，不易感染噬菌体；

（4）最好选用产生胞外酶的菌种，有利于酶的分离，回收率高；

此外，在食品和医药工业上，还应考虑安全性问题。

联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）的食品添加剂专家联合委员会（JEFA），就有关酶的生产应用安全问题提出：

（1）凡是从动植物可食部分组织或食品加工传统使用的微生物生产的酶，可作为食品对待，无须进行毒物学研究，而只需建立有关酶化学与微生物学的详细说明即可；

（2）凡是由非致病菌的一般食品污染微生物所制取的酶，需作短期的毒性实验；（3）由非常见的微生物制取的酶，应作广泛的毒性实验，包括慢性中毒在内。

2、菌种分离

（1）含酶菌种收集

可从两方面收集菌种：

一是根据微生物的生态特征，从自然界中取样，分离出所需菌种；二是从发酵生产材料中进行分离。

（2）富集培养：

当样品中所需菌种含量较低时，在控制PH、温度和营养成分等条件下让微生物大量繁殖，以利筛选。

（3）菌种纯化：

一般采用划线分离法或稀释分离法进行纯化，以获得纯的菌种。

3、菌种培养：

●目的是确定以何种方式可获得高的酶产量，一般采用固体培养法和液体培养法。

●在菌种培养时，结合菌种的筛选和纯化一般需进行培养物的酶活力的测定。

二、酶的发酵技术

1、培养基的营养成分

（1）碳源：

碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。

有机碳的来源：

一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质的原料；二是野生的如土茯苓、石蒜等淀粉质的原料。

（2）氮源：

氮素是生物体内各种含氮物质的组成成分，酶制剂生产中的氮源分有机态氮和无机态氮两种。

（3）无机盐：

产酶培养基常需添加一定量的无机盐，主要是P、S、K、Mg、Ca、Na盐等

（4）微量元素：

产酶培养基微量元素有Fe、Mn、Zn、Cu、Co等。

（5）生长因子：

微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正常生长发育，统称生长因子或生长素。

（6）产酶促进剂：

●于培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。

●产酶促进剂分为两种：

一是诱导物，二是表面活性剂。

●表面活性剂能增加细胞的通透性，处在气—液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶的活性。

●生产上常采用非离子型表面活性剂，离子型表面活性剂对微生物有害。

2、发酵条件对产酶的影响

（1）温度对产酶的影响：

一般细菌为37℃，霉菌和放线菌为28~30℃，一些嗜热微生物需在40~50℃下生长繁殖

（2）PH对产酶的影响

生产中控制PH的方法：

①添加缓冲液维持一定的PH；②调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定的范围；③调节培养基的原始PH，保持一定的C/N比；④当发酵液PH过高时用糖或淀粉来调节，过低时，通过氮调节。

（3）通风量对产酶的影响：

通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定

（4）搅拌的影响：

搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的新陈代谢，从而有利于新陈代谢；同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气的利用。

（5）泡沫的影响：

泡沫的存在阻碍了二氧化碳的排除，影响溶氧量。

生产上的消泡措施，一般采用机械消泡和利用消泡剂。

（6）湿度：

一般前期湿度低些，培养后期湿度大些，有利于产酶。

三、提高酶产量的方法

1、酶合成的调节机制：

酶合成主要取决于转录的速度，原核细胞的调控目前接受的是操纵子模型。

诱导与阻遏

有些酶在通常情况下不合成或者很少合成，当加入诱导物后，就会大量合成，这种现象叫诱导。

诱导作用是由于阻遏蛋白与诱导物结合而发生别构，失去与操纵子结合的能力。

结构基因能转录并翻译成相应的酶，这些酶就叫诱导酶。

许多参加分解代谢的酶类，如淀粉酶、纤维素酶等都是诱导酶。

尾产物阻遏：

当有些酶的作用产物积累到一定浓度，并能满足机体需要后，酶的合成就会受阻；

分解代谢产物阻遏：

当细胞在容易利用的碳源（葡萄糖）上生长时，有些酶，特别是参与分解代谢的酶类，其合成受阻；又叫葡萄糖效应。

2、打破酶合成调节机制限制的方法：

①控制条件，包括添加诱导物和降低阻遏物浓度；②遗传控制，包括基因突变和基因重组；③其他，如添加表面活性剂、产酶促进剂等。

（1）通过条件控制提高酶产量

①添加诱导物：

只适用于诱导酶的合成，关键在于选择适宜的诱导物及其浓度。

●诱导物包括：

酶的作用底物，一些难以代谢的底物类似物，诱导物的前体物质。

●诱导物在诱导作用范围内，其浓度与酶形成速度成正比，当浓度继续增加时，酶生成的速度趋向平稳，最后达到一饱和值。

②降低阻遏物的浓度

●对于受分解代谢阻遏的酶：

可直接限制碳源或相应的生长因子的供应；

●对于合成代谢的酶：

有两种方法解决尾产物阻遏：

一是在培养基中添加尾产物类似物形成的抑制剂；二是采用营养缺陷型菌株，并限制其生长必需因子的供应。

（2）通过基因突变提高酶产量：

一是使诱导型变成组合型，即获得的菌株在没有诱导物存在的条件下酶产量达到诱导的水平；二是使阻遏型变为去阻遏型，即获得的突变株在引起阻遏的条件下，酶产量达到无阻遏的水平。

诱变的方法：

●物理方法：

如紫外线、γ-射线、快中子射线等，可引起DNA分子中的碱基A、T、C、G特别是C、T发生过氧化反应，造成DNA损伤或畸变；

●化学方法：

一是5-溴代尿嘧啶等通过代谢参入DNA引起突变；二是亚硝酸等通过DNA中的碱基A、C、G等直接引起化学反应而导致突变；三是嘧啶黄染料等是通过插入或缺失核苷酸而造成移码突变。

（3）其他提高酶产量的方法

●加表面活性剂：

通常采用非离子型表面活性剂；目前认为，表面活性剂可能是提高了细胞膜的透性，有助于打破细胞内酶合成的“反馈平衡”。

●其他产酶促进剂

mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在，是影响酶合成模式的主要因素：

（1）mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对应的酶；

（2）mRNA稳定性差的，随着细胞停止生长而终止酶的合成；

（3）不受培养基中阻遏物阻遏的，可随着细胞生长而开始酶的合成；

（4）受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入平衡期后，解除阻遏，酶才开始合成。

第二章酶的分离纯化

酶的分离纯化包括三个基本环节：

1、抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；

2、纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；

3、制剂，即将酶制成各种剂型。

分离纯化过程中应注意的问题：

1、要注意防止酶的变性失活；2、在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”手段；

3、在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性。

第一节酶活性测定

酶活力：

也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。

酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。

酶反应速度（初速度）：