CER4合成的关键酶Word格式文档下载.docx
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RiedererandSchreiber,2001）。
角质层能够保护潜在的组织防止UV紫外线过量的辐射、机械损害、细菌、致病菌的侵染（Jenksetal.,2002）以及昆虫的迫害（EigenbrodeandEspelie,1995）。
而且，角质层在植物的生长过程中通过阻止临近器官细胞壁融合而发挥关键作用（Sieberetal.,2000）。
角质层主要由角质素和腊类组成。
角质素是角质层的主要成分，由C16和C18羟基组成，环氧脂肪酸单体（Heredia,2003）以三维矩阵的方式覆盖于上皮细胞壁。
表皮蜡质被包埋在角质素矩阵内，覆盖于真角质层（上表皮）。
表皮蜡质通常以晶体的形式存在，并以足够浓度的结晶花传输到植物体的表面。
表皮蜡质是一个脂肪复合混合物，主要由长链脂肪族分子组成，包括伯，仲醇，醛类，烷烃类和酯类，这些主要来自于饱和长链脂肪酸的派生（VLCFAs）。
每种脂质类都以一系列长链特征出现（e.g.C24,C26,C28,C30）或以一个长链占主要成分。
不同物种之间蜡质的承载量和组分是具有不同变化的（Post-Beittenmiller,1996）。
甚至在一个物种上，不同器官和组织的蜡质成分也是变化的，但生长期间除外。
在生殖生长过程中蜡质的沉积或许受环境信号的变化而影响，如光照，湿度和温度等（Kolattukudy,1996）。
蜡质生物合成的第一个阶段为发生在质体中饱和的C16和C18脂酰CoA的延长，产生长度为20和34之间碳原子VLCFA腊前体。
通过内质网（ER）的多酶系统-脂肪酸延长酶来催化脂肪酸的延长（vonWettstein-Knowles,1982）。
长链脂酰CoA被合成后，它们将通过脱羰基途径转化为醛类中间体和奇数烷烃类，仲醇和酮类（CheesbroughandKolattukudy,1984;
Schneider-BelhaddadandKolattukudy,2000），或者通过脂酰还原途径转化为伯醇和腊酯类（KunstandSamuels,2003）.。
尽管主要的蜡质生物合成步骤已经被确定下来，但是我们对于酶类的参与以及它们催化生物化学反应的机理的了解是有限的。
仅有小部分已知功能编码生物合成酶类基因从拟南芥（Arabidopsisthaliana）和玉米（Zeamays）中被克隆出来。
例如：
CER6,KCS1,GL8A,GL8B,和CER10是脂肪酸延长酶的组分，是产生VLCFA腊前体所必须的（Xuetal.,1997;
Millaretal.,1999;
Toddetal.,1999;
Fiebigetal.,2000;
Dietrichetal.,2005;
Zhengetal.,2005）。
CER1,GL1,和WAX2是都包含3个富His特征的一系列完整细胞膜酶类（Aartsetal.,1995;
Hansenetal.,1997;
Chenetal.,2003;
Kurataetal.,2003;
Sturaroetal.,2005）。
尽管其新陈代谢作用已经被阐述，但是目前还不能掌握相关蛋白的生物化学反应。
其它的基因可能编码蜡质产生中的调控蛋白CER2,GL2,CER3,GL15,和WIN1/SHN1（Tackeetal.,1995;
Hannoufaetal.,1996;
MooseandSisco,1996;
Negruketal.,1996;
Xiaetal.,1996;
Aharonietal.,2004;
Brounetal.,2004），但是它们的调控功能仍旧需要被证实。
最终，CER5编码一个定位在质膜上的ATP绑定转运子，其是腊转运到角质层所必须要求的（PighinandZhengetal.,2004）。
显而易见，在蜡质相关基因克隆过程中，没有特异性的酶类催化脂肪酸延长一系列反应。
所以，当前关于酰基还原途径描述的大部分信息来自于早期对于植物角质层腊的形成阐述，以及来自于近期参与器官和组织中VLCFA伯醇和烷烃，酯类相关基因特征研究中。
蜡形成的生物化学机理首先在甘蓝中被检测（Brassicaoleracea），获得的假说为这个过程包括两个阶段，分别由两个独立的酶类所催化的，一个是NADH依赖型脂酰还原酶（FAR），其降低脂酰CoA形成自由的醛类，另一个为NADPH依赖型醛基还原酶，其将醛类转化为伯醇（Kolattukudy,1971）。
随后在荷荷芭（Simmondsiachinensis）胚胎（Pollardetal.,1979）和豌豆（Pisumsativum）的叶片（Vioqueand Kolattukudy,1997）中进行了生物化学研究，荷荷芭特异性醇－形成FAR基因在异源的蚕类昆虫，小鼠和人类细胞中功能表达（Metz etal.,2000），说明了VLCFAｓ的醇生物合成是通过一个单一醇－形成FAR所催化的无醛类中间体释放过程。
拟南芥中相应的FARｓ参与蜡质生物合成还没有被研究，也不了解是否在酰基还原途径中从脂酰CoA前体到伯醇这个过程有一个或者两个酶催化。
早期的研究（Hannoufaetal.,1993;
McNevinetal.,1993;
Jenksetal.,1995）已经确立Arabidopsiscer4突变株茎秆几乎完全缺乏伯醇（andwaxesters），说明了CER４参与脂酰还原途径（Jenks etal.,1995）。
将光滑的表面的茎秆与野生型拟南芥绿色茎秆表面进行比较，通过目视法筛选突变株已经分别鉴定出cer4等位基因。
在Ler生态型（Koornneefetal.,1989）中Cer4-1是一个快中子诱发突变株，在Ws生态型（McNevinetal.,1993）中cer4-2是一个T-DNA诱导突变株。
这项工作的目标就是克隆和描述混乱在拟南芥cer4突变株中的基因，研究是否CER4蛋白
（1）的确是FAR；
（2）能够形成醛类和伯醇；
（3）具有长链特异性酯酰底物；
（4）负责植株所有器官中蜡质醇的形成；
（5）确定它的亚细胞定位。
结果
CER4基因的分子鉴定
将假定的荷荷芭FAR氨基酸序列利用BLAST检索拟南芥基因组数据库，结果显示在拟南芥基因组中有8个序列与荷荷芭FAR整个长度是高度相关的（28%-54%氨基酸序列）（图1）。
序列之一MS2（At3g11980），这个基因编码花粉受精所必需的膜特异性蛋白（Aartsetal.,1997），但是拟南芥中其它7个FAR类基因没有被研究过。
为了确定是否这些基因相对应的CER4参与角质层伯醇的形成，我们利用拟南芥图谱对比cer4突变体与鉴定的FAR类序列。
假定的FARs之一，At4g3390，在4号染色体60.9cm与CER4基因图谱匹配（Koornneefetal.,1989），考虑到这可能是CER4的候选体。
At4g33790基因克隆序列与全长cDNA序列（GenBankaccessionnos.AY057657andAY070065;
Yamadaetal.,2003）比较显示出一个错误的基因组序列（GenBankaccessionno.NC_003075）。
这个错误是一个附加的核苷酸造成预测的编码序列阅读框的移动。
正确的At4g33790基因由10个外显子组成（Fig.2A），整个外显子-内含子区域共有3567bp。
全长cDNA序列包含一个1482bp开放阅读框，编码一个493氨基酸蛋白质。
Cer4-1突变体中At4g33790基因的PCR扩增结果表明一个缺失部分或者至少3350bp含有500bp启动子区域将重新排列，5’端未翻译区域，翻译起始下游至少有2800bp。
突变株cer4-2中一个T-DNA插入序列出现在At4g33790（atnucleotide1,960relativetothestartcodon）的第4个内含子上。
两个带有相同光滑茎秆蜡质表现型突变株系的独立分离相同基因上都发生变化的结果表明确定At4g33790编码CER4。
为了证实CER4基因的存在，从拟南芥生物资源中心（ABRC）的At4g33790中我们获得了2个SALKT-DNA插入株系，SALK-038693（cer4-3）和SALK-000575（cer4-4），分别包含第五个（nucleotide2,225）和第四个（nucleotide1,755）外显子嵌入的T-DNA。
Cer4-1和cer4-2纯合体表现出光滑茎秆表现型与前期描述的cer4-1和cer4-2株系相似。
最终，cer4基因敲出的范围通过半定量反转录（RT）-PCR来检测。
在cer4-2，cer4-3和cer4-4株系探测到CER4mRNA是低水平的，另一方面在cer4-1中没有发现转录产物（Fig.2B）。
总体来说，这些结果表明CER4与FAR类基因At4g3370是相同的。
Cer4突变株茎秆表皮蜡质的化学和形态学变化
我们发现三个拟南芥野生型株系的总蜡质承载量是非常相似的，其范围Ws20ug/cm2-23ug/cm2Ler和Columbia-0（Col-0;
TableI）。
四个突变株系花絮茎秆总蜡质覆盖不同于各自的野生型。
而且，脂肪酸，醛类，烷烃类，伯醇和酮类的绝对量和相对量在野生型株系之间和cer4株系以及相应的野生型蜡质混合物是存在差异的（TableI;
Fig.3）。
CER4突变株的复合物类别中伯醇和烷酯类相比于野生型分别减少了2-3ug/cm2和1-4ug/cm2，在突变株系中这些成分仅仅是微量的（TablesIandII）。
对cer4-1复合物内长链类型的检测表明个体蜡质复合物成分是没有变化的。
最显著的效果是C24，C26和C28伯醇，这三种复合物在四个突变株系的茎秆蜡质中降低到微量。
与之相反的是，C30伯醇在cer4-1角质层中是积累的，为野生型水平的16%（Fig.3）。
我们在cer4-2和cer4-3发现相似长链类型的伯醇，另一方面在cer4-4中C24和C26醇类表现出显著地降低（datanotshown）。
野生型株系的烷酯类表现出的链长度范围在C38-C54之间，并带有一个重要的偶数同系物和大量的C44（TableII）。
与之相比较，突变株系cer4-1，cer4-2和cer4-3的偶数酯类水平大幅度降低，而奇数复合物没有表现出此类现象。
余下的偶数酯类在C46和C50，C54表现出一个双峰分布。
依据质谱分析法（MS）数据显示酯类部分受C45酯类的控制，主要成分是C29醇酯化成的C16:
0酸。
因为在拟南芥茎秆蜡质中这是一个重要的长链的仲醇，所以这些残留的酯类很可能含有仲醇29烷烃-14-ol和-15-ol。
这些醇类在cer4突变株中没有做进一步分析，因为仲醇形成是在无FAR酶类参与的脱羰途径和酰基还原途径。
所有酯类的偶数烷烃部分利用MS数据进行了量化，并依据呈现的醇链长度进行了总结。
另一方面，Col-0野生型酯类主要由C26烷烃链所占据，在突变体系cer4-1，cer4-2，和cer4-3中这些醇类数量是显著下降的。
反之，在他们茎秆蜡质中C22和C30醇类水平是显著增加的，C24和C28醇类也随之变化。
cer4-4中的蜡质表明酯类成分介于野生型和其它3种突变体系之间。
尽管cer4植株茎秆总蜡质承载量与野生型植株接近，但是4个突变体系的茎秆都表现出光滑。
这种现象说明了cer4茎秆角质层蜡晶体受突变的影响。
因为之前并没有对cer4植株中的晶体进行过报道，通过扫描电子显微镜检查法我们检测到cer4-1茎秆中蜡晶体的浓度和形状（SEM;
Fig.4）。
角质层蜡晶体紧密排列组成标注杆，微管，纵向和横向维管束，网状板块覆盖在野生型拟南芥茎秆的表面（Fig.4,AandB）。
相反，cer4-1植株茎秆表面几乎缺乏蜡晶体，反而具有一个相对光滑表面的厚蜡质层（Fig.4,CandD），说明是表层光反射系数变化的原因。
假如我们能够提供进一步的证据鉴定出CER4基因，那么我们将通过与At4g33790基因组序列互补作用来改变蜡质的化学成分和表面形态学（Fig.3;
TableI）。
酵母中CER4的异源性表达
为了证实CER4是一个醇形成FAR，并参与长链伯醇产生，我们利用酵母（Saccharomycescerevisiae）GAL1启动子表达了1482bpCER4基因的编码区域。
在诱导条件下，细胞将转变富含C16：
0，C16：
1，C18：
0，C18：
1和CER6：
0脂肪酸，而没有探测到脂肪醇类（Fig.5A）。
相反，酵母细胞表达的CER4产生了2种新型复合物。
利用气相色谱（GC）和质谱分析（MS）方法鉴定出它们含有伯醇CER4：
0-OH和CER6：
0-OH（Fig.5B）。
CER4表达细胞所积累的CER26：
0脂肪酸表达水平与对照酵母中是一致的。
从获得的饱和和非饱和的C16和C18脂肪酸中未探测到伯醇。
在GAL1启动子控制下，利用绿色荧光蛋白（GFP）标记酵母表达的CER4cDNAN-末端，进行了CER4FAR的亚细胞定位。
GFP抗原表位与CER4蛋白质的融合，并没有影响到酵母中修饰酶FAR的活性，需要我们利用共焦显微镜做进一步的观察。
该试验揭示了酵母ER的荧光类型（Fig.6A,arrow）。
利用hexylrhodamineB,进行酵母细胞的复染，该染料能够染色ER，观察相同的细胞区域（Fig.6,C–E），证实了CER4存在于酵母的ER中。
预测的CER4蛋白质特征
CER4转录产物编码493个氨基酸多肽，其分子量大约在56.0KD。
预测的CER4蛋白质序列与荷荷芭胚胎（Metzetal.,2000）相关的膜依赖型NADPH醇形成FAR的相似度为54%，长度相同（Fig.7）。
CER4的序列大部分与拟南芥的MS2（36%氨基酸），其它的拟南芥FAR家族的6个成员的序列相似（31-39%氨基酸，SupplementalFig.S1）。
从注释基因数据库中获得了非特异性拟南芥FARs编码序列，随后人为的重注释获得更多的编码学列和推断出来的聚合肽序列。
5个拟南芥FARs大小相似于CER4，长度为482-496残基。
At3g56700和MS2（At3g11980）具有未知功能的氨基末端，长度分别为548和516个残基。
CER4是拟南芥FAR大部分与荷荷芭FAR描述的生物化学特征密切相关（Fig.1）。
CER4与小麦中的另一个特异性蛋白TAA1a高度相关（42%氨基酸），已经证实这个蛋白能够合成初级脂肪醇，对花粉的形成和功能具有重要作用（Wangetal.,2002;
Fig.7）。
除此之外，CER4中简短的氨基酸区域功能上大体与蚕类昆虫的信息素腺（Motoetal.,2003），小鼠的FAR1和FAR2酶功能相同（ChengandRussell,2004;
荷荷芭FAR被认为是一个含有2个跨膜区域的完整膜蛋白质，跨膜区域分别在309-329，378-398之间。
在这两个预测的片段中CER4具有相似数量的疏水残基（Fig.7）。
然而，亲水性图谱和其它的序列分析程序并没有强烈的说明在CER4蛋白质序列中具有跨膜区域。
所以仍旧不确定是否这些片段是FAR酶类的跨膜区域。
推测的CER4氨基酸序列缺乏典型的NAD（p）H绑定位点或罗斯曼折叠：
GXGXX（G/A）（Wierengaetal.,1986）。
Aartsetal.（1997）推测MS2通过一个相关的核苷酸绑定序列（I/V/F）X（I/L/V）TGXTGFL（G/A）与NAD（P）H绑定，CER4包含这个位点，大约在19-29残基之间（Fig.7）.
CER4基因表达分析
利用半定量RT-PCR技术来研究CER4基因在不同的组织中的转录水平（Fig.8）。
取材为6周拟南芥植株的地上组织和14d种苗的根部组织。
CER4在所有的组织中都表达，但表达水平保持不变。
在开放的花朵和根部中转录产物积累水平最高。
在茎秆，闭合花朵和长角果中的转录水平中度；
检测到CER4转录产物在丛生和茎叶中发现最低。
为了更细节的分析CER4的细胞表达类型，将CER4编码区域的上游2.1kb基因组序列融合一个β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因（GUS）（CER4pro:
GUS），构建之后用于拟南芥的转化。
来自20个独立转基因株系的组织样品用活跃的GUS进行标记，其中对4个株系特征进行了详细的描述。
报告基因在嫩枝和根部都表达，这与RT-PCR分析相一致（Fig.9）。
在茎秆的表皮细胞中，CER4被完全表达（Fig.9,AandB）。
通过原位杂交，我们证实了CER4在花朵的上表皮特异性表达（Fig.9C），还发现CER4表达仅仅限制在嫩枝和花分生组织的下端区域。
在莲座叶毛状体的表皮细胞，CERpro：
GUS强烈表达（Fig.9E）。
叶片限制性表达类型或许解释了在整个叶片组织中CER4转录产物低水平表达，因为这些转录产物将通过扁平细胞和潜在的叶肉细胞而减弱。
CER4在茎叶中的表达更为普遍，并在毛状体，扁平细胞和脉管系统也被探测到，尤其在叶片基部高表达（Fig8）。
在花朵的花瓣，雄蕊花丝和心皮中探测到CER4pro-GUS活性（Fig.9F）。
CER4转录产物的原位杂交证实了其在心皮中表达，这种表达方式为表皮特异性（Fig.9G）。
在长角果中CER4pro：
GUS活跃于长角果的外层，但是在种子中不活跃（Fig.9H）。
意外的是，我们在14d种苗根中央和外层也探测到了CER4的表达（Fig.9I），而在根尖中未探测到（Fig.9J）。
CER4在根尖后的延长区域的表达是强烈的，而在分生区域的老化部分表达减弱（Fig.9I）。
尽管表皮细胞GUS染色比内部细胞更明显一些在延长区域的所有细胞类型中探测到了GUS活性（Fig.9K）。
讨论
野生型拟南芥茎秆总蜡质沉积中伯醇成分为10%-15%，叶片中自由醇或者腊酯为15%-25%。
CER4突变株的茎秆和叶片几乎终止了伯醇的形成，表明CER4是催化生物合成的关键酶。
在这项研究中，我们利用cer4克隆到了CER4（At4g33790）基因，描述了在蜡质产生过程中CER4的功能。
CER4（At4g33790）基因编码分子量为56KD的蛋白质，与报道的荷荷芭和豌豆FAR酶数值相似（VioqueandKolattukudy,1997;
Metzetal.,2000），与荷荷芭蛋白质的序列相似。
FAR酶催化酯酰CoA为底物的硫代酸酯的裂解，以及借助NAD（P）H辅酶转移电子将脂肪酸还原成醇类的反应。
为了直接的评价CER4FAR还原酶的活性，进一步的研究其底物特异性，我们将CER4cDNA在酵母中进行表达。
CER4表达的酵母积累了C24和C26特异性长链醇类。
野生型酵母细胞也产生了鞘脂类合成C20和C22脂肪酸。
然而，在CER4表达载体中未探测到C20和C22自由醇，表明这些酰基可能不是CER4FAR的底物和CER酶所必需。
短链醇的缺乏，特别是C16和C18，表明CER4不能利用丰富的饱和和非饱和的C16和C18酯酰CoA作为底物。
这与蚕类昆虫的FAR相反，当它们在异源酵母中表达后产生了C16和C18脂肪醇（Motoetal.,2003），荷荷巴中的FAR，当在细菌中表达是产生了C16:
0和C18：
1脂肪醇（Metzetal.,2000）。
酵母转化株表达的CER4FAR不能产生蜡酯，表明至少在酵母细胞中CER4不能从产生伯醇形成蜡酯。
酵母中CER4底物特异性显现出cer4突变株确立的蜡质图谱与预先报道的一致，缺乏C24和C28自由醇（Hannoufaetal.,1993;
McNevinetal.,1993;
Jenksetal.,1995）。
然而，cer4突变株仍旧积累大量的C30醇类，表明额外的FAR同工酶可能参与它们的产生。
除了MS2以外，一个膜状层特异性蛋白石花粉形成所必须的（Aartsetal.,1997），其它的6个拟南芥FAR同工酶的功能是未知的。
微阵列分析表明这些基因中的5个表达被限制在特异性组织类型中，另一方面1个是被广泛的表达（Schmidetal.,2005）。
当然，仅仅有At3g56700在茎秆中高度表达，所以其也是产生C30伯醇的候选基因。
正如我们所期望的，在cer4突变株的烷酯成分由于C24-C28伯醇的缺乏而受到重要影响，这些伯醇主要被用来蜡质合成到产生表皮烷烃酯。
有趣的是，尽管伯醇和烷酯水平大量的降低，cer4突变株几乎是野生型茎秆蜡质沉积（TableI），然而它们的茎秆还具有光泽的。
对Cer4茎秆表面SEM研究表明，它们由相对光滑薄膜所覆盖，而缺少蜡质晶体，形成光滑的茎秆表面。
这些数据表明伯醇和腊酯是角质层蜡晶体形成所必需的。
不太可能的是，蜡晶体本身是由两种单独的腊酯成分形成的，因为烷烃类，仲醇和酮类组成了拟南芥茎秆沉积（approximately75%）的主要部分，也是晶体形成的主要成分。
所以，对于缺乏酰基还原产物怎样阻碍了蜡晶体形成的机理还不是很清楚。
在茎秆的表皮细胞中唯一的探测到CER4转录产物。
在cer4突变株的表现型中期待CER4在嫩芽表层中的表达，这个突变株缺乏角质层蜡沉积在茎秆的表面的伯醇。
这就表明至少在茎秆中，CER4伯醇功能是形成表皮蜡质。
CER4也在叶片表皮细胞中表达，但是在莲座叶中仅限制在毛状体细胞类型中。
在毛状体中发现了CER2（Xiaetal.,1997）和WAX2/YRE1（Kurataetal.,2003）的特异性表达。
我们分析了4个缺乏腺毛突变株gl1,gl2,gl3和ttg1，奇怪的是不能探测到伯
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