冷藏牛肉之氧化肌红蛋白还原与肌肉解读Word文件下载.docx

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212,Sec.9,Yein-PingN.Rd.,Taipei,Taiwan.

Abstract

DecreaseinHunter’s“a”andincreasein“L”wereobservedinbeefsampleswrappedwith/withoutPEfilmduring120hstorageat4oC.Met-myoglobinreductaseactivityofbothsamplesdecreased,whilethemet-Mbincreasedwiththedurationofstorage.TheNADHofbeefsamplewrappedwithPEfilmincreasedfrom771to855nmol/gduringthefirst16hofstorage,butdecreasedsharplyto0nmol/gafter120h.However,thatofunwrappedbeefdecreasedwiththedurationofstorage,to20nmol/gafter120h.AlthoughtheNADPHofbothwrappedandunwrappedsamplesdecreasedwiththedurationofstorage,thetotalamountofNADHandNADPHseemedtoremainataconstantlevelduringthefirst80hstorageandthensignificantlydecreasedduringfurtherstorage.

Keywords:

Beef,Color,Met-myoglobinreductase,Met-myoglobin,Reducednicotinamideadeninedinucleotide（NADH）,Reducednicotinamideadeninedinucleotidephosphate（NADPH）.

前　言

消費者在判斷肉的品質，乃藉由三個官感性質（外觀、質感（嫩度）和香味）來認定。

這三種特性中以產品的外觀為最重要，因為它直接影響消費者在決定購買與否。

新鮮牛肉色澤的維持是短暫，表面的變色是不可避免的變質現象且被認為鮮度不佳的指標。

因此，消費者往往會去除此部份之肉塊（Kropfetal.,1986），尤其細碎的肉最易變色且會降低其商品價值。

因此，業界與消費者皆承認肉品顏色安定性的重要。

近來所發展的調氣包裝（MAP），即為延長新鮮肉之貯藏期限而研發之技術（FaustmanandCassens,1990）。

一般而言，在肌肉組織之色素主要有血紅素（Hb）和肌紅素（Mb），當動物被屠宰後，Hb因放血而大幅減少，因此Mb變為形成肉色之主要物質。

在組織中還原型的Mb是紫色，而氧合型的oxy-Mb則為鮮紅色，兩者達平衡狀態而呈鮮紅色。

Mb及oxy-Mb之鐵皆呈還原態（ferrous）（Crossetal.,1986）。

當肌肉暴露於空氣時，則氧會與Mb之heme結合產生oxy-Mb。

改變肉色主要是因Mb之heme中鐵分子被氧化所致。

Mb被氧化生成oxy-Mb是在heme自由結合位置與氧形成共價鍵結合（ClydesdaleandFrancis,1971），Mb之另一型態為氧化型肌紅蛋白（met-Mb），此乃因Mb分子上鐵離子被氧化由Fe+2變成Fe+3使肉色呈暗褐色，但在電子傳遞介質和還原酵素如NADH，細胞色素b5還原酵素之存在下，則會發生逆轉反應，使met-Mb還原為Mb（Crossetal.,1986；

Ariharaetal.,1995）。

影響肌肉變色之因子很多，例如：

依肌肉met-Mb的還原能力（包括酵素活性及其輔因子）、氧的存在及Mb自氧化速率而定（RenerreandLabas,1987）。

本研究主要探討牛肉在冷藏中氧化肌紅蛋白還原酶與肌肉色澤變化之關連性，提供進一步探討冷藏牛肉變色機制之資訊。

材料與方法

（一）、材料：

1、原料：

牛肉（beef）。

2、藥品：

Reducednicotinamideadeninenucleotide（NADH）,Reducednicotinamideadeninedinucleotideposphate（NADPH），dihydroxyacetonephosphatedimethylketal（DAP），2-oxoglutarate-Na2-2H2O，NH4Cl，glycerol-3-phosphatedehydrogenase（GDH），Glutamatedehydrogenase（GIDH）均為Sigma產品。

Potassiumdihydrogenphosphate、di-potassiumhydrogenphosphate、potassiumferricyanide、ethylenediaminetetraaceticacid（EDTA）、ammoniumsulfate為林純藥工業株式會社產品。

3、器材：

（1）色差儀：

ModelTC-10Analyzer,DenshokuCo.,Tokyo,Japan。

（2）低溫高速離心機：

SCR20BA,HitachiCo.,Japan。

（3）桌上型離心機：

Centrifuge5415C,Appendorf,WestGerman。

（4）pHmeter：

HM-30S,TOAElectronicLTD.,Japan。

（5）分光光度計：

HitachiU-2001,HitachiCo.,Japan。

（二）、方法：

1、樣品處理：

原料牛肉是從台北之傳統市場獲得，立即運送至實驗室（3-5oC）。

牛肉在購買後立即切割成4×

4×

1cm大小並將樣品分兩組，分別使用PE膜包裝及不包裝，而後貯藏於4oC左右之冰箱，模擬超市之販賣進行貯藏試驗，並測定met-Mb還原酶活性變化與色澤安定性、met-Mb生成速率、肌肉中還原態菸鹼醯胺腺核苷酸（NADH）及還原態菸鹼醯胺腺二核苷磷酸（NADPH）量之變化之關連性。

2、pH之測定：

取3g細碎牛肉加15ml之蒸餾水，並均質後以pHMeter測定之。

3、牛肉顏色之測定：

以色差儀（ModelTC-10Analyzer,DenshokuCo.,Tokyo,Japan）測定牛肉之L、a、b值，並以標準白板X=90.84、Y=92.60、Z=109.11校正。

4、met-Mb%之測定（尾藤，1974）：

取約0.5mloxy-Mb溶液，加入相同體積之1.0M磷酸緩衝液（pH7.0），並打入CO與之混合（A1）；

另一部分之oxy-Mb溶液經氧化後，亦以上述相同方法處理（A2），最後在波長568nm下測定吸光值；

第三部分加1﹪potassiumferricyanide使Mb溶液完全變成met-Mb（A3），在波長568nm下測吸光值。

Met-Mb含量可由如下公式估算之：

5、粗met-Mb還原酵素液之製備及酵素活性之測定（Yamanaka等，1973a；

Lowry等，1951及Al-Shaibani，1977）：

（1）、製備粗酵素液：

取3g牛肉，加入3倍之20mM磷酸緩衝液（4C,pH7.0），於4C均質1分鐘後，於4C下以14,000xg（8,000rpm）離心25分鐘，取上澄液即為粗酵素液。

（2）、酵素活性的測定：

在含有3ml之0.2M磷酸緩衝液（pH7.0）、0.1ml之0.1mM亞甲基藍（methyleneblue）和0.1ml的粗酵素液的反應液中，添加0.5ml純的bluefintunamet-Mb溶液充分混合，反應在添加0.5ml之1mMNADPH後開始以分光光度計測定5分鐘內在406nm波長下吸光值之變化。

酵素活性是以分光光度計在406nm波長下測定吸光值降低量。

1個酵素活性單位定義為在25C下一分鐘內能還原1mole之met-Mb的酵素量（Al-Shaibanietal.,1977）。

6、NADH及NADPH之測定（Bergmeyer，1983）：

（1）鹼萃取：

取20ml冷的KOH（0.5M）注入離心瓶並保存在-17C，另秤取2g快速凍結之組織放入離心瓶中，經攪拌並在90C水槽中搖動加熱5分鐘後迅速置於0C之冰浴冷卻，取出上層之澄清、黃褐色溶液部份並緩慢加入1mlTEA/phosphatemixture，在冰浴中攪拌調整pH為7.8後置於室溫下10分鐘，以30,000xg（16,000rpm;

4C）下離心5分鐘。

（2）定量：

於2mlsample中加入0.05mlsubstratemixture，並測定339nm下之吸光值（2、5、10分鐘之吸光值），得A1。

於2mlsample中加入0.005mlGDHsuspension（Glycerol-3-phosphatedehydrogenase），並測定339nm下之吸光值（2、5、10分鐘之吸光值），得A2。

A1（NADH）=A1-A2。

於2mlsample中加入0.005mlGIDHsuspension（Glutamatedehydro-genase），並測定339nm下之吸光值（2、5、10分鐘之吸光值），得A3。

A2（NADPH）=A3-A2。

結果與討論

經過包PE膜與不包PE膜對牛肉pH並無顯著之影響（p＜0.05，數據沒有顯示）。

於貯藏期間，牛肉之pH呈緩慢遞減，pH介於6.2–5.8之間，Nonakaetal.（1976）提及ATPase在pH5.8-6.1及pH8.7-9.0活性最大，推測冷藏120h之牛肉樣品仍處在僵直的狀態。

Huntera值（色澤安定及紅色度的指標），包PE膜之牛肉在貯藏至56小時，由25.64緩慢下降至24.17，貯藏至120小時後，則快速下降至19.62；

但不包PE膜之牛肉貯藏120小時後，a值由25.64降至17.89（表1）。

由圖1觀察得知，貯藏120小時後牛肉褐變度加深。

包PE膜與不包PE膜牛肉之Huntera值，隨貯藏（4oC）時間（120小時）之延長而下降，但L值（亮度）隨貯藏（4oC）時間（120小時）之延長而明顯上升，且不包PE膜牛肉比包PE膜牛肉之L值來的高（表1）。

兩組樣品均貯藏在恒溫恒濕機（相對濕度100﹪，4oC）中，並無乾燥對色澤影響之疑慮。

而Huntera值在120小時明顯下降，除了Mb本身之氧化外，脂質的氧化亦會伴隨著met-Mb之形成，導致a值的下降（LinandHultin,1977）。

此乃因脂肪氧化所產生的自由基之中間產物會破壞heme蛋白及Metmyoglobinreductaseactivity（MRA）。

因為在販賣初期，色澤的安定與否，氧的消耗速率是重要因子，而當氧化速率降至最低時，色澤的安定性即相對的提高。

而牛肉在56小時貯藏內，a值無顯著改變，表示氧化速率呈平緩狀態，此對色澤的安定性有幫助。

由此可確認在販賣初期，主要的變色是在表面，推測此時的氧化速率高於metMbreductase的還原能力。

依據Hashimoto和Watabe（1988）及Ochiaietal.（1988）的研究報告指出，鮪魚肌肉冷凍解凍後保水性下降導致met-Mb的形成，並因此造成鮪魚肌肉L值的上升。

本實驗中也觀察到這個現象。

因此L值的上升極可能是因牛肉保水性的下降及met-Mb的上升（圖2）所造成的。

Hunterb（黃/藍）值，在兩組樣品均無顯著改變（p>

0.05），其值在15-18之間（表1）。

氧化肌紅蛋白（met-Mb）：

牛肉貯藏在4oC、120小時後，包PE膜與不包PE膜之氧化肌紅蛋白含量分別由原先的24.6﹪上升至55.6﹪及49.1﹪（圖2）。

在不包PE膜之牛肉中，被推測具低氧化速率與高酵素活性，因肉中含有高濃度的氧會擴散至空氣中。

另一方面，包PE膜之牛肌肉因膜之障礙，氧較不容易擴散，因此肉中殘存之氧濃度相對較高，所以氧化肌紅蛋白含量較高。

肌肉中肌紅蛋白（Mb）的氧化是肌肉褐變之一重要環節，較不安定之肌肉具有較高的自氧化速率（RenerreandLabas,1987）。

Livingstonetal.（1986）曾指出牛肌肉，暴露在空氣中與一定的氧量接觸，肌紅色素極容易被氧化而改變其結構。

無論如何，雖然在肉中自氧化作用是一重要的反應，但仍有許多細節須進一步深入探討。

酵素活性：

Atkinson和Follett（1973）曾發現氧化肌紅蛋白還原活性（met-Mbreducingactivity,MRA），對羊肉、牛肉及豬肉的表面變色並無相關性。

幾年後，O’Keefe和Hood（1985）報告指出不管在有氧或無氧的狀態下，MRA能輕微的影響色澤的安定性。

而vandenOord（1974）報告指出，在有氧的情況下met-Mb並不能被還原，似乎對肉色的安定性無影響。

Walters和Taylor（1963）及Renerre和Labas（1987）發現在有氧的狀態下比無氧的狀態下，met-Mb更易被met-Mb還原酶還原。

然而牛肉中met-Mb還原酶的比活性在貯藏8小時雖呈下降之趨勢，但在8-56小時之貯藏中，met-Mb還原酶的比活性維持一定，爾後則隨貯藏時間之延長而下降（圖3）。

包PE膜與不包PE膜之酵素活性遞減趨勢非常相似的（圖3）。

色澤的安定性在貯藏120小時過程均呈下降趨勢，可能由於met-Mb還原酶活性的下降所致。

而met-Mb的蓄積與met-Mb還原酶活性呈負相關性（圖2及3）。

這個結果與Hutchinsetal.（1967）及Madhavi和Carpenter（1993）研究牛肉色澤的結果一致。

Ledward（1985）更進一步指出，肉中met-Mb的蓄積與met-Mb還原酶活性的高低有關。

在有氧還原系統中，影響氧合肌肉層最劇的是在表層，這可解釋為何碎肉的色澤較易被氧化，而整塊肌肉較不易變色（Ledwardetal.,1977;

Kropfetal.,1986）。

在這個研究中所得的數據，在120小時貯藏過程中牛肉的變色，可能是Mb的氧化速率大於met-Mb的還原速率所造成。

NADH和NADPH：

Rossi-Fanellietal.（1957）指出藉著酵素系統能夠還原met-Mb，例如NAD還原酶和NADP還原酶。

另有許多作者指出藉由不同的電子傳遞途徑，可把NADH之電子傳遞至met-Mb中（Stewartetal.,1965;

SalehandWatts,1968）。

met-Mb還原酶需要NADH，它是一個利於met-Mb還原的介質，這在哺乳動物心肌中（Hagleretal.,1979），哺乳動物骨骼肌中（Matsuietal.,1975）及魚骨骼肌中（Al-Shaibanietal.,1977;

Levyetal.,1985）均被探討過。

在本研究中，包PE膜與不包PE膜樣品，貯藏在16及32小時時NADH的含量會增加，之後則降低（圖4）。

然而，包PE膜之樣品，在貯藏56小時後，NADPH的含量迅速降至0nmol/g，而在不包PE膜樣品中，NADPH的含量仍有殘存（圖5）。

NADH與NADPH含量的改變，推測發生的原因可能是可利用還原的NADH及NADPH的激酶，在死後硬直醣解作用中，於細胞質內因電子的傳遞作用使NAD轉變為NADH（Ariharaetal.,1996）。

雖然這個途徑能夠提供met-Mb還原酶作用中所需的NADH（Gidding,1977），NADH生成後立即會與met-Mb還原酶產生鍵結，因為游離的NADH在呈酸性肉中且低pH下極不安定（Klingenberg,1985）。

因此NADH及NADPH仍留在細胞中的氧化還原池中。

由圖4及5，NADH與NADPH的含量變化呈現出一種跳動式的變化，當NADH的含量高時，NADPH含量即低，呈互補性的變化（圖4及5）。

雖然含量呈跳動式變化，但還是有一定數量的電子供應（例如：

NADH或NADPH），這些電子供應者存在於細胞中的氧化還原池中。

依據上述，NADH與NADPH的總量來自於醣解作用，早期貯藏時含量增加，爾後減少，此推測可能是肝醣在早期貯藏時分解成丙酮酸所致，爾後貯藏時再被分解成乳酸。

Met-Mb還原酶活性及NADH+NADPH含量的減少，使得氧化還原速率的下降，這是造成貯藏過程中met-Mb蓄積的主要原因。

綜合上述所言，貯藏80小時內之牛肌肉，色澤及met-Mb的含量無顯著改變。

這可能由於Mb氧化成met-Mb的速率與met-Mb還原酶還原met-Mb的速率，兩者成一平衡狀態，因為於此階段有提供充足的met-Mb還原酶活性及NADH＋NADPH。

然而，貯藏在80-120小時階段，met-Mb還原酶活性與電子供應者的含量下降，這結果後來導致Mb的氧化速率大於met-Mb的還原速率。

雖然某些早期的研究如牛肉、羊肉及豬肉，但他們並不認為met-Mb的蓄積並不是因MRA降低的關係；

但此次實驗數據的獲得，很明顯的得知牛肌肉貯藏過程中met-Mb還原酶是met-Mb蓄積的一個重要因子。

參考文獻

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