冷藏牛肉之氧化肌红蛋白还原与肌肉解读Word文件下载.docx

1、212, Sec. 9, Yein-Ping N. Rd., Taipei, Taiwan.AbstractDecrease in Hunters “a” and increase in “L” were observed in beef samples wrapped with/without PE film during 120 h storage at 4oC. Met-myoglobin reductase activity of both samples decreased, while the met-Mb increased with the duration of storag

2、e. The NADH of beef sample wrapped with PE film increased from 771 to 855 nmol/g during the first 16 h of storage, but decreased sharply to 0 nmol/g after 120 h. However, that of unwrapped beef decreased with the duration of storage, to 20 nmol/g after 120h. Although the NADPH of both wrapped and un

3、wrapped samples decreased with the duration of storage, the total amount of NADH and NADPH seemed to remain at a constant level during the first 80 h storage and then significantly decreased during further storage. Key words: Beef, Color, Met-myoglobin reductase, Met-myoglobin, Reduced nicotinamide

4、adenine dinucleotide（NADH）, Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）.前言消費者在判斷肉的品質，乃藉由三個官感性質（外觀、質感（嫩度）和香味）來認定。這三種特性中以產品的外觀為最重要，因為它直接影響消費者在決定購買與否。新鮮牛肉色澤的維持是短暫，表面的變色是不可避免的變質現象且被認為鮮度不佳的指標。因此，消費者往往會去除此部份之肉塊 （Kropf et al., 1986），尤其細碎的肉最易變色且會降低其商品價值。因此，業界與消費者皆承認肉品顏色安定性的重要。近來所發展的調氣包裝 （MAP）

5、，即為延長新鮮肉之貯藏期限而研發之技術 （Faustman and Cassens, 1990）。一般而言，在肌肉組織之色素主要有血紅素 （Hb） 和肌紅素 （Mb），當動物被屠宰後，Hb因放血而大幅減少，因此Mb變為形成肉色之主要物質。在組織中還原型的Mb是紫色，而氧合型的oxy-Mb則為鮮紅色，兩者達平衡狀態而呈鮮紅色。Mb 及 oxy-Mb之鐵皆呈還原態 （ferrous） （Cross et al., 1986）。當肌肉暴露於空氣時，則氧會與Mb之heme結合產生oxy-Mb。改變肉色主要是因Mb之heme中鐵分子被氧化所致。Mb被氧化生成oxy-Mb是在heme自由結合位置與氧形成共

6、價鍵結合 （Clydesdale and Francis, 1971），Mb之另一型態為氧化型肌紅蛋白 （met-Mb），此乃因Mb分子上鐵離子被氧化由Fe+2變成Fe+3使肉色呈暗褐色，但在電子傳遞介質和還原酵素如NADH，細胞色素b5 還原酵素之存在下，則會發生逆轉反應，使 met-Mb 還原為Mb （Cross et al.,1986；Arihara et al.,1995）。影響肌肉變色之因子很多，例如：依肌肉met-Mb的還原能力（包括酵素活性及其輔因子）、氧的存在及 Mb 自氧化速率而定 （Renerre and Labas, 1987）。本研究主要探討牛肉在冷藏中氧化肌紅蛋白還原

7、酶與肌肉色澤變化之關連性，提供進一步探討冷藏牛肉變色機制之資訊。材料與方法（一）、材料：1、原料：牛肉 （beef）。2、藥品： Reduced nicotinamide adenine nucleotide（NADH）, Reduced nicotinamide adenine dinucleotide posphate（NADPH），dihydroxyacetone phosphate dimethyl ketal （DAP）， 2-oxoglutarate-Na2-2H2O，NH4Cl ，glycerol-3-phosphate dehydrogenase （GDH），Glutamate

8、 dehydrogenase （GIDH） 均為Sigma 產品。Potassium dihydrogen phosphate、di-potassium hydrogen phosphate、potassium ferricyanide、ethylenediamine tetraacetic acid（EDTA）、ammonium sulfate 為林純藥工業株式會社產品。3、器材：（1）色差儀：Model TC-10Analyzer, Denshoku Co., Tokyo,Japan。（2）低溫高速離心機：SCR20BA, Hitachi Co., Japan。（3）桌上型離心機：Cent

9、rifuge 5415C, Appendorf, West German。（4）pH meter：HM-30S, TOA Electronic LTD., Japan。（5）分光光度計：Hitachi U-2001, Hitachi Co., Japan。（二）、方法：1、樣品處理：原料牛肉是從台北之傳統市場獲得，立即運送至實驗室（3-5oC）。牛肉在購買後立即切割成441 cm大小並將樣品分兩組，分別使用PE膜包裝及不包裝，而後貯藏於 4oC左右之冰箱，模擬超市之販賣進行貯藏試驗，並測定met-Mb還原酶活性變化與色澤安定性、met-Mb生成速率、肌肉中還原態菸鹼醯胺腺核苷酸（NADH）及還

10、原態菸鹼醯胺腺二核苷磷酸（NADPH）量之變化之關連性。2、pH之測定：取3 g細碎牛肉加15 ml 之蒸餾水，並均質後以pH Meter測定之。3、牛肉顏色之測定：以色差儀 （Model TC-10Analyzer, Denshoku Co., Tokyo, Japan） 測定牛肉之L、a、b值，並以標準白板X=90.84、Y=92.60、Z=109.11校正。4、met-Mb%之測定 （尾藤，1974）：取約0.5 ml oxy-Mb溶液，加入相同體積之1.0 M磷酸緩衝液 （pH 7.0），並打入CO與之混合 （A1）；另一部分之oxy-Mb溶液經氧化後，亦以上述相同方法處理 （A2），

11、最後在波長568 nm下測定吸光值；第三部分加1 potassium ferricyanide使Mb溶液完全變成met-Mb （A3），在波長568 nm下測吸光值。Met-Mb含量可由如下公式估算之：5、粗met-Mb 還原酵素液之製備及酵素活性之測定 （Yamanaka等， 1973a；Lowry 等，1951及Al-Shaibani，1977）：（1）、製備粗酵素液：取3 g牛肉，加入3倍之20 mM磷酸緩衝液（4C, pH 7.0），於4C均質1分鐘後，於4C下以14,000 x g （8,000 rpm）離心25分鐘，取上澄液即為粗酵素液。（2）、酵素活性的測定：在含有3 ml 之

12、0.2 M磷酸緩衝液 （pH 7.0）、0.1 ml 之0.1 mM亞甲基藍（methylene blue）和0.1 ml的粗酵素液的反應液中，添加0.5 ml 純的bluefin tuna met-Mb溶液充分混合，反應在添加0.5 ml 之1 mM NADPH後開始以分光光度計測定5分鐘內在406 nm波長下吸光值之變化。酵素活性是以分光光度計在406 nm波長下測定吸光值降低量。1個酵素活性單位定義為在25C下一分鐘內能還原1 mole 之met-Mb的酵素量 （Al-Shaibani et al., 1977）。6、NADH及NADPH之測定 （Bergmeyer，1983）：（1）

13、鹼萃取：取20 ml冷的KOH （0.5 M） 注入離心瓶並保存在-17C，另秤取2 g快速凍結之組織放入離心瓶中，經攪拌並在90C水槽中搖動加熱5分鐘後迅速置於0C之冰浴冷卻，取出上層之澄清、黃褐色溶液部份並緩慢加入1 ml TEA / phosphate mixture，在冰浴中攪拌調整pH為7.8後置於室溫下10分鐘，以30,000 x g （16,000 rpm; 4C）下離心5分鐘。（2）定量： 於2 ml sample中加入0.05 ml substrate mixture，並測定339 nm下之吸光值（2、5、10 分鐘之吸光值），得A1。 於2 ml sample中加入0.00

14、5 ml GDH suspension （Glycerol-3-phosphate dehydrogenase），並測定339 nm下之吸光值 （2、5、10 分鐘之吸光值），得A2。A1 （NADH） = A1-A2。 於2 ml sample中加入0.005 ml GIDH suspension （Glutamate dehydro-genase），並測定339 nm下之吸光值（2、5、10 分鐘之吸光值），得A3。A2 （NADPH） = A3-A2。結果與討論經過包PE膜與不包PE膜對牛肉pH並無顯著之影響 （p0.05，數據沒有顯示）。於貯藏期間，牛肉之 pH 呈緩慢遞減，pH 介於

15、 6.2 5.8 之間，Nonaka et al. （1976） 提及ATPase在pH 5.8-6.1及 pH 8.7-9.0活性最大，推測冷藏120h之牛肉樣品仍處在僵直的狀態。Hunter a 值（色澤安定及紅色度的指標），包PE膜之牛肉在貯藏至56小時，由25.64緩慢下降至24.17，貯藏至120小時後，則快速下降至19.62；但不包PE膜之牛肉貯藏120小時後，a值由25.64降至17.89 （表1）。由圖1觀察得知，貯藏120小時後牛肉褐變度加深。包PE膜與不包PE膜牛肉之Hunter a 值，隨貯藏 （4oC） 時間 （120 小時） 之延長而下降，但L值 （亮度） 隨貯藏 （

16、4oC） 時間 （120 小時） 之延長而明顯上升，且不包PE膜牛肉比包PE膜牛肉之L值來的高 （表1）。兩組樣品均貯藏在恒溫恒濕機（相對濕度100，4oC）中，並無乾燥對色澤影響之疑慮。而Hunter a值在120 小時明顯下降，除了Mb本身之氧化外，脂質的氧化亦會伴隨著 met-Mb 之形成，導致a值的下降 （Lin and Hultin, 1977）。此乃因脂肪氧化所產生的自由基之中間產物會破壞 heme 蛋白及 Metmyoglobin reductase activity （MRA）。因為在販賣初期，色澤的安定與否，氧的消耗速率是重要因子，而當氧化速率降至最低時，色澤的安定性即相對的

17、提高。而牛肉在56小時貯藏內，a 值無顯著改變，表示氧化速率呈平緩狀態，此對色澤的安定性有幫助。由此可確認在販賣初期，主要的變色是在表面，推測此時的氧化速率高於metMb reductase 的還原能力。依據Hashimoto 和 Watabe （1988） 及 Ochiai et al. （1988） 的研究報告指出，鮪魚肌肉冷凍解凍後保水性下降導致met-Mb的形成，並因此造成鮪魚肌肉L值的上升。本實驗中也觀察到這個現象。因此L值的上升極可能是因牛肉保水性的下降及met-Mb的上升 （圖 2） 所造成的。Hunter b （黃/藍） 值，在兩組樣品均無顯著改變（p0.05），其值在15-1

18、8之間 （表1）。氧化肌紅蛋白 （met-Mb）：牛肉貯藏在4oC、120 小時後，包PE膜與不包PE膜之氧化肌紅蛋白含量分別由原先的24.6上升至55.6及49.1（圖 2）。在不包PE膜之牛肉中，被推測具低氧化速率與高酵素活性，因肉中含有高濃度的氧會擴散至空氣中。另一方面，包PE膜之牛肌肉因膜之障礙，氧較不容易擴散，因此肉中殘存之氧濃度相對較高，所以氧化肌紅蛋白含量較高。肌肉中肌紅蛋白 （Mb） 的氧化是肌肉褐變之一重要環節，較不安定之肌肉具有較高的自氧化速率 （Renerre and Labas, 1987）。Livingston et al. （1986） 曾指出牛肌肉，暴露在空氣中與

19、一定的氧量接觸，肌紅色素極容易被氧化而改變其結構。無論如何，雖然在肉中自氧化作用是一重要的反應，但仍有許多細節須進一步深入探討。酵素活性：Atkinson和Follett （1973）曾發現氧化肌紅蛋白還原活性 （met-Mb reducing activity, MRA），對羊肉、牛肉及豬肉的表面變色並無相關性。幾年後， OKeefe和Hood （1985）報告指出不管在有氧或無氧的狀態下，MRA能輕微的影響色澤的安定性。而van den Oord （1974） 報告指出，在有氧的情況下met-Mb並不能被還原，似乎對肉色的安定性無影響。Walters和Taylor （1963） 及Rene

20、rre和Labas （1987） 發現在有氧的狀態下比無氧的狀態下，met-Mb更易被met-Mb還原酶還原。然而牛肉中met-Mb還原酶的比活性在貯藏8小時雖呈下降之趨勢，但在8-56小時之貯藏中，met-Mb還原酶的比活性維持一定，爾後則隨貯藏時間之延長而下降 （圖 3）。包PE膜與不包PE膜之酵素活性遞減趨勢非常相似的 （圖 3）。色澤的安定性在貯藏120 小時過程均呈下降趨勢，可能由於met-Mb還原酶活性的下降所致。而met-Mb的蓄積與met-Mb還原酶活性呈負相關性（圖 2及3）。這個結果與Hutchins et al. （1967） 及Madhavi和Carpenter （19

21、93） 研究牛肉色澤的結果一致。Ledward （1985） 更進一步指出，肉中met-Mb的蓄積與met-Mb還原酶活性的高低有關。在有氧還原系統中，影響氧合肌肉層最劇的是在表層，這可解釋為何碎肉的色澤較易被氧化，而整塊肌肉較不易變色 （Ledward et al., 1977; Kropf et al., 1986）。在這個研究中所得的數據，在120 小時貯藏過程中牛肉的變色，可能是Mb的氧化速率大於met-Mb的還原速率所造成。NADH 和NADPH：Rossi-Fanelli et al. （1957） 指出藉著酵素系統能夠還原met-Mb，例如NAD還原酶和NADP還原酶。另有許多作

22、者指出藉由不同的電子傳遞途徑，可把NADH之電子傳遞至met-Mb中 （Stewart et al., 1965; Saleh and Watts, 1968）。met-Mb還原酶需要NADH，它是一個利於met-Mb還原的介質，這在哺乳動物心肌中 （Hagler et al., 1979），哺乳動物骨骼肌中 （Matsui et al., 1975） 及魚骨骼肌中 （Al-Shaibani et al., 1977; Levy et al., 1985） 均被探討過。在本研究中，包PE膜與不包PE膜樣品，貯藏在16及32小時時NADH的含量會增加，之後則降低 （圖 4）。然而，包PE膜之樣品

23、，在貯藏56小時後，NADPH的含量迅速降至0 nmol/g，而在不包PE膜樣品中，NADPH的含量仍有殘存 （圖 5）。NADH與NADPH含量的改變，推測發生的原因可能是可利用還原的NADH 及 NADPH 的激酶，在死後硬直醣解作用中，於細胞質內因電子的傳遞作用使NAD轉變為NADH （Arihara et al., 1996）。雖然這個途徑能夠提供met-Mb還原酶作用中所需的NADH （Gidding, 1977），NADH生成後立即會與met-Mb還原酶產生鍵結，因為游離的NADH在呈酸性肉中且低pH下極不安定 （Klingenberg, 1985）。因此NADH及NADPH仍留在

24、細胞中的氧化還原池中。由圖4及5，NADH與NADPH的含量變化呈現出一種跳動式的變化，當NADH的含量高時，NADPH含量即低，呈互補性的變化（圖4及5）。雖然含量呈跳動式變化，但還是有一定數量的電子供應（例如：NADH或NADPH），這些電子供應者存在於細胞中的氧化還原池中。依據上述，NADH與NADPH的總量來自於醣解作用，早期貯藏時含量增加，爾後減少，此推測可能是肝醣在早期貯藏時分解成丙酮酸所致，爾後貯藏時再被分解成乳酸。Met-Mb還原酶活性及NADH+NADPH含量的減少，使得氧化還原速率的下降，這是造成貯藏過程中met-Mb蓄積的主要原因。綜合上述所言，貯藏80小時內之牛肌肉，色

25、澤及met-Mb的含量無顯著改變。這可能由於Mb氧化成met-Mb的速率與met-Mb還原酶還原met-Mb的速率，兩者成一平衡狀態，因為於此階段有提供充足的met-Mb還原酶活性及NADHNADPH。然而，貯藏在80-120小時階段，met-Mb還原酶活性與電子供應者的含量下降，這結果後來導致Mb的氧化速率大於met-Mb的還原速率。雖然某些早期的研究如牛肉、羊肉及豬肉，但他們並不認為met-Mb的蓄積並不是因MRA降低的關係；但此次實驗數據的獲得，很明顯的得知牛肌肉貯藏過程中met-Mb還原酶是met-Mb蓄積的一個重要因子。參 考 文 獻Al-Shaibani, K. A., R. J.

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