3T3L1细胞实验操作Word格式.docx
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3、加入2ml10%FBS,打圈混匀,吸1ml,每皿大概5~6滴入新的培养皿(大皿10滴~1ml),其余弃掉,后加3ml10%FBS(大皿8ml),大概可2天传代。
4、换液时需缓慢吸弃旧培养基,DMEM清洗细胞(注意换枪头杜绝污染)后吸弃,10%FBS贴壁加入3ml。
三、细胞接板(全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌)
24孔板:
560μl细胞+6ml10%FBS(12个样)【600μl分化1.2ml增殖】
12孔板:
1400μl细胞+11ml10%FBS
用25ml瓶一板对一瓶装
1、准备好12孔板、24孔板各两份(两皿细胞)、DMEM、血清、25ml瓶4个、软管。
2、配10%FBS90mlDMEM+10ml血清
3、第一二瓶各6ml10%FBS,第三四瓶各11ml10%FBS
4、吸弃旧培养基,加2mlDMEM摇晃清洗,吸弃,500μl一皿细胞胰酶消化,显微镜观察细胞分散开来即停止消化。
5、每皿加入2ml10%FBS,1ml枪头打圈吹散。
6、将两皿细胞集中在一个培养皿,打圈吹散。
7、560μl细胞分别加入一二瓶混匀,1400μl细胞分别加入三四瓶混匀。
8、一二瓶对应加500μl细胞进24孔板(加12个孔)摇晃混匀,
三四瓶对应加1ml细胞进12孔板,摇晃混匀。
放培养箱,第二天进行转染。
四、细胞转染(无酶EP管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌)
1、准Opti-MEM,灭菌水,mic(inhibitor),NC,Lipo3000,无酶EP管、无酶小管,96孔枪头板,12孔板、24孔板各2板(工具照紫外)
2、NC、mic(inhibitor)4℃1500r1.5min离心
3、分装Lipo3000tube管150μl一管(轻混),mic(inhibitor)、NC小管(换枪头加灭菌水稀释,按说明书要求),标记好
4、分装Opti-MEM20ml入瓶待用
5、计算好体系:
(n为样品数量,N为总样品数量)
Mic:
①45μl+600μlOpti-MEM(12孔板)---3.75μlMic*n+50μlOpti-MEM*n;
②22.5μl+300μlOpti-MEM(24孔板12个样)---1.875μlMic*n+25μlOpti-MEM*n
NC:
③45μl+600μlOpti-MEM(12孔板)---3.75μlNC*n+50μlOpti-MEM*n;
④22.5μl+300μlOpti-MEM(24孔板12个样)---1.875μlNC*n+25μlOpti-MEM*n
LP:
⑤84μl+1200μlOpti-MEM(12孔板)---3.5μlLP*N+50μlOpti-MEM*N;
⑥36μl+600μlOpti-MEM(24孔板12个样)---1.5μlLP*N+25μlOpti-MEM*N
Inhibitor:
①90μl+600μlOpti-MEM(12孔板)---7.5μlinh*n+50μlOpti-MEM*n;
②45μl+300μlOpti-MEM(24孔板12个样)---3.75μlinh*n+50μlOpti-MEM*n
③90μl+600μlOpti-MEM(12孔板)---7.5μlNC*n+50μlOpti-MEM*n;
④45μl+300μlOpti-MEM(24孔板12个样)---3.75μlNC*n+50μlOpti-MEM*n
6、标记好tube管:
①mic45μl+600μl;
②mic22.5μl+300μl;
③NC45μl+600μl;
④NC22.5μl+300μl;
⑤LP84μl+1200μl;
⑥LP36μl+600μl。
①in90μl+600μl;
②in45μl+300μl;
③NC90μl+600μl;
④NC45μl+300μl;
注意:
LP需轻轻混匀,⑤平均分至①③;
⑥平均分至②④,加后轻轻混匀。
静置5min,拿出接板后的12孔板、24孔板细胞观察。
7、将旧培养基吸弃,12孔板每孔1mlOpti-MEM+100μl转染液;
24孔板每孔500μlOpti-MEM+50μl转染液(12个孔)
8、加完晃匀,6h后换10%FBS,放培养箱42h后换诱导液开始进行诱导。
五、细胞诱导分化(全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌)
配置储备液:
IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):
分子量:
222.2g/mol(Sigma:
I5879)-20℃保存(难溶最后溶)
用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml(0.5mol/L)储存液
即:
0.0115gIBMX+940ulddH2O+60ulKOH
需用滤嘴过滤至新瓶子
终浓度为0.5mmol/L。
(现配现用)
DEX:
392.5g/mol(Sigma:
D4902)-20℃保存
用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液
0.2mgDEX+0.5ml无水乙醇
终浓度为1umol/L。
Insulin:
25mgInsulin+12.5mlHCl
溶解后过滤,PCR小管分装,终浓度为2ug/ml,-20℃保存。
1、待3T3-L1细胞在24孔板,毎板100μl原细胞体积+400μl10%FBS养2天长满,配制诱导液诱导3T3-L1分化。
(先配好10%FBS两瓶100ml的)
2、将旧培养液软管吸弃,PBS清洗,吸弃PBS,加入配制好的诱导液I每孔500μl于24孔板中,培养2天。
3、将培养液软管吸弃,PBS清洗,吸弃PBS,用200ul的枪头慢慢加入配制好的诱导液II每孔500μl于24孔板中,培养2天。
4、将旧培养液软管吸弃,PBS清洗,吸弃PBS,用10%FBS培养基培养2天。
5、细胞油红O染色的操作步骤:
①、10%中性甲醛的配制
材料:
中性甲醛(多聚甲醛)
密封瓶。
方法:
称取1g中性甲醛粉末,加入10ml的超纯水中,密封,在60度水浴中过夜才能溶解。
配好的溶液1个星期内有效,最好4度保存。
②、染色液的配制
油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、针筒、滤嘴
称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉,溶于少量异丙醇中,然后加异丙醇至100ml,60℃水浴溶解,棕色瓶密封(或锡箔纸包裹避光)4℃保存,为储存液,可长期保存。
用时取6ml加超纯水4ml混匀,滤嘴过滤,稀释后数小时内用完。
1、吸弃培养基,用PBS洗2遍,加入10%的甲醛固定30min~1h(贴壁加),期间过滤油红
2、吸弃10%甲醛,用超纯水洗2遍,60%异丙醇孵育5min
3、吸弃60%异丙醇,均匀覆盖oilredO染20min(6孔板2ml,12孔板1ml,24孔板500μl)
4、吸弃oilredO后,用超纯水洗2~5遍,直至无污点
5、加苏木精孵育细胞1min,吸弃苏木精,超纯水2~5遍
6、在细胞上加超纯水观察
若转染诱导成功,重新转染诱导一批细胞,进行一系列实验:
流式细胞术:
(无酶枪头、1.5mltube管)注意用前灭菌
1、准备接板好的12孔板细胞、无酶枪头、tube管、96孔板。
2、摆好12个tube管,把原来1ml10%FBS培养基吸至tube管,一组一枪头,吸1mlPBS清洗细胞(悬空加)。
吸弃PBS,一组一枪头,吸100~150μl胰酶消化细胞(两排两排消化),显微镜观察第一个,吸弃胰酶,将原培养基从tube管一一对应吸回去12孔板,并吹匀细胞,轻轻吹打。
显微镜观察是否吹匀。
3、将消化并吹匀的细胞悬液吸回去tube管,一对一,3000g离心5min。
4、吸上清,留沉淀,大概留50μl,调950μl吸弃上清。
5、悬空加入4℃冷却的PBS1ml,吹匀细胞,3000g离心5min,吸弃PBS(950μl+50μl两次小心吸弃)。
6、加300μl4℃冷却的PBS,吹匀细胞,避免成团。
7、缓慢悬空加入700μl预冷的70%无水乙醇,轻轻吹打均匀,4℃保存(可一周)。
PI染色:
1、准备好染色剂、25ml用锡箔纸包好的小瓶、24孔板、锡箔纸。
算好体系,多配一个样,加入小瓶备用。
现配现用,当天使用,4℃保存:
染色缓冲液(n+1)*0.5ml
-20℃碘化丙啶染色液(20x)(n+1)*25μl
保存RNaseA(50x)(n+1)*10μl避光配制
Total(n+1)*0.535ml先加多后加少容易混匀
2、将样品5000g离心6min,沉淀细胞。
小心吸除上清,850μl+50μl吸弃上清,预留50μl左右的乙醇,以免吸走细胞。
3、加入4℃PBS,洗涤一次,离心5000g5min,沉淀细胞,小心吸除上清,850μl+50μl吸弃上清,预留50μl左右的PBS,以免吸走细胞。
4、轻轻弹击tube管底,使细胞分散,避免成团。
5、染色:
每管样品中加入0.535ml染色液,缓慢并充分重悬细胞,37℃避光(样品放入24孔板用锡箔纸包好)温浴(放烘箱)30min,随后4℃或冰浴避光(样品垂直插入携带冰箱内冰)存放。
染色完成后宜24h内或当日完成检测,最好当天完成。
CV变异系数CV越低,峰值越好,越尖锐,5%左右效果较好,一般<10%即可。
提RNA的收样(无酶枪头、1.5mltube管)注意用前灭菌
①一组组分好不同枪头吸弃培养基,加入500μlRNAiso放5min。
②标记好无酶1.5mltube管,反复刮取、吸取细胞,将细胞移至tube管(不同组必须换枪头,移完盖好)。
③收样存放-80℃。
RNA提取(无酶枪头、1.5mltube管)
①从-80℃冰箱取出样品
↓静置5min后12000r,4℃离心10min
②上清移至新的1.5mltube管并标记好
↓加入
RNAisoPlus等体积的氯仿(一般为100μl)震荡摇匀
③室温静置5min
↓12000r,4℃离心15min
④将上清转移至新的tube管并标记好(150~200μl)
↓加与上清液等体积的异丙醇,颠倒混匀
⑤室温静置10min
↓13000r,4℃离心10min
⑥弃上清,向沉淀加入1ml的75%乙醇颠倒清洗沉淀
(离心时以管头朝内侧,则沉淀会附于管外侧,加入乙醇时从内侧,勿触沉淀,设阴性对照,即横板为dH2O)
⑦弃上清,留沉淀
↓14000r,4℃离心3min
⑨吸走多余的75%乙醇
↓操作台风干2min
⑩各加入8μlDEPC溶解
检测纯度:
打开软件→按“Acid”→按“否”→选RNA
↓每次吸2μlDEPC先洗3遍,用滤纸弄干
用2μlDEPC每洗1次按Blank,Measure
↓洗到
0.5为止
每个样品吸2μl,Measure(每测完一次都要擦干)
↓
保存(Report)
RNA稀释:
(mRNA定量C统一为200miRNA定量C统一为500)
(V剩=6μl)
miRNA定量(冰上操作、无酶离心管、无酶枪头)
①取已稀释的RT引物5μl,加入45μlRNA-Free水。
准备好96孔板,引物RT,U6RT,放在冰上。
②多配一个体系:
miRNA-RT引物2μl(n+1)
U6RT2μl(n+1)
RNA不少于1500ng(1500ng/C统一=3μl)
无菌ddH2O4μl(n+1)
总体积11μl(n+1)
RT引物用前稀释;
配②体系时,RT引物和U6RT的量是固定的,模板和水的量是浮动的;
只在一个引物里面加内参;
下游引物是通用的;
不够的体系用无菌ddH2O配平;
做完样品后保存至-20℃;
如果接下来要做miRNA定量,则放在4℃备用。
样品1
样品2
样品3
样品4
样品5
样品6
↑
11μl体系②
③后对应加入模板(1500ng/C统一=)3μl,标记好,放入小型离心机,离心一下,再放入PCR仪
70℃10min,冰上2min(程序:
000)
④放一管无酶tube管,多配一个体系,加入体系:
5xbuffer5μl(n+1)
Mix1μl(n+1)
无菌ddH2O8μl(n+1)
总体积:
14μl(n+1)
14μl体系④
即总体积:
25μl
42℃1h,37℃15min,98℃5min(程序:
0000)
⑤多配一个体系(n+1),混匀,引物瞬时离心:
SYBR10μl(n+1)
F0.8μl(n+1)
R(通用)0.8μl(n+1)
ddH2O6.4μl(n+1)
除去模板2μl,总体积18μl(n+1)
⑥在冰上铺一次性手套,按96孔板在冰里,放好定量小管,标记好
⑦每个小管对应加18μl体系⑤,每个样都要有U6作为参照:
cDNA
1
2
3
4
5
6
miR
miR体系⑤
U6
U6体系⑤
盖上盖子,注意勿污染,用一次性手套隔着按紧定量管盖子,用镊子轻轻撬松定量小管,离心一下。
⑧去杨老师那,打开Real-time机,桌面miRNApcrd,然后OK→Next→选第三个→OpenLid,放样品,用一次性手套按一下,最后CloseLid→StarRun,选择文件夹命名好保存,直到机器绿灯亮起,登记好走人。
RT-PCR(冰上操作、无酶离心管、无酶枪头)
①按1:
50比例加1μlgDNARemover入50μl4xDNAmastermix
②标记、加样、低速离心,加2μlRNA进管,RNA热变性5min65℃,冰上冷却
③先配总4xDNAmastermix2μl(固定)
后分装dH2O4μl(根据样品而定)
C统一为200
RNA模板(样品)2μl(≤0.5μg)
Total8μl
37℃5min冰上冷却注:
n为样品数量
④上述反应液8μl
5xRTmixII2μl
Total10μl
37℃15min,50℃5min,98℃5min,4℃保存
⑤加ddH2O稀释40μl--即稀释5倍(换枪头混匀,4℃保存)
mRNA定量(冰上操作、无酶离心管、无酶枪头)
1、反应体系
试剂
体积
2×
SYBR
10μL
上游引物
0.8μL
下游引物
灭菌水
5.4μL
RNA模板
3μL
总体积
20μL
2、冰上操作,准备好各种规格的无酶枪头、tube管、引物、定量管
3、计算体系,多配2个
4、摆好定量管、tube管,标记好,先加体系(加中间,勿碰壁)
5、加样一个对应一种引物
6、加盖盖紧,离心
7、打开Mrd_RT→StarRun→OpenLid按顺序摆好→CloseLid→StarRun选好文件夹,保存好,开始。
WesternBlot
细胞蛋白收样(冰上操作、无酶EP管、无酶枪头)
1、n个样,n*2个EP管(一式两份),实验前2-3分钟准备试剂(RIPA、PI),打冰。
2、把要收的样小心吸弃培养基,注意一组一枪头。
3、1ml冷冻的PBS清洗,吸弃,换组换枪头。
4、配蛋白裂解液:
六孔板每孔150μl/十二孔板每孔100μl,多配一点,RIPA:
PI=100:
1。
5、按体系算好,加入,晃匀,4℃冰箱孵育30min,打开4℃离心机。
6、用200μl枪头吸匀刮取后加入至tube管,12000x/g(即12000rcf)离心15min
7、移上清至新无酶小管(先吸上部分,下部分10μl枪头慢慢吸,维持140μl~150μl),收样完后-80℃保存。
蛋白浓度测定(冰上操作、无酶tube管、无酶枪头)
1、BCA法
BCA试剂:
取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。
此试剂可稳定一周。
(需先计算体系,即
)
标准蛋白质溶液:
所买试剂浓度5mg/ml,用时稀释成1mg/ml的溶液。
(从5mg/ml的标准蛋白溶液吸取12.6μl加入50.4μl的RIPA共配63μl的1μg/μl的标准蛋白溶液)
实验操作:
绘制标准曲线
取96孔酶标板,按下表加入试剂。
标准曲线的绘制(表1)
管号
7
8
标准蛋白溶液(μl)
12
16
20
63μl
RIPA(μl)
19
18
BCA试剂(μl)
200
蛋白质浓度(mg/ml)
0.025
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
上述试剂加完后,准确吸取20μl样品(10μl样品+10μlRIPA)溶液于酶标孔中,加入BCA试剂200μl,轻摇,于37℃保温30-60min,冷却至室温后,以空白为对照,在酶标仪上590nm处比色---
打开酶标仪,把96孔板盖去掉放进酶标仪并合上,电脑打开Gen5,点击BCA.pot,点OK即可导出Excel。
以牛血清白蛋白含量为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。
以标准曲线空白为对照,根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量----
保存Excel文件,选中测得标准蛋白溶液吸光度为横坐标,蛋白质浓度为纵坐标,插入XY散点图,右击表中的散点,添加趋势线,选择多项式,勾选显示公式以及R平均值。
将样品吸光值copy成列,将样品测得吸光值带入公式即可求得C所测样品稀释后浓度,由于所测20μl样品是10μl原样品+10μlPBS,即稀释2倍,所以C该样品实际浓度=2×
C所测样品稀释后浓度,n该样品体系最小物质量=C最小所测体系浓度*V最小浓度体积,V所取体积=n该样品体系最小物质量/C该样品体系浓度,
,VSDS=V所取体积/4。
(V最小浓度体积为测得最小浓度的样品剩下体积;
C所测样品稀释后浓度为代入公式后的浓度)
蛋白变性
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
上样体积:
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(LoadingBuffer)=4:
1,离心一下,沸水煮10分钟,以充分变性蛋白。
一、流程图
制胶(1h)→电泳跑胶(80V40min110V140min&
90V30min)→转膜(80V50min&
)→TBST清洗5次(每次5min)→封闭(1.5h)→TBST清洗5次(每次5min)→附Ⅰ抗(内参:
小鼠抗β-Actin,先摇床轻摇30min,再放冰箱4度过夜)→TBST清洗三次(5min/次)→附Ⅱ抗(内参:
山羊抗小鼠,轻摇1h)→TBST清洗三次(5min/次)→显影
二、物料及配制
1、电泳液:
一包电泳粉+1000ml双蒸水(可回收使用)
2、10%过硫酸铵:
1g过硫酸铵+10ml双蒸水
3、转膜液:
一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇(可回收使用)
4、TBST溶液:
50ml20