中国基因工程原理讲义单链噬菌体载体及噬菌粒载体Word格式文档下载.docx

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D．可容易地测出外源DNA的插入取向。

E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途（作为模板）：

*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序

*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针

*3利用寡核苷酸进行定点突变

2．M13phage的生物学特性

A．M13phage同f1phage亲缘关系十分密切，例如：

1基因组组织形式相同；

2病毒颗粒大小、形状相近；

3DNA同源性高达98%以上。

B．在M13phage颗粒中只有（+）链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；

M13噬菌体的（+）链DNA，又称为感染性单链DNA。

C．复制型双链DNA（RFDNA=ReplicationFormDNA）

感染过程：

当感染的M13phage颗粒穿过性须时，其外层主要衣壳蛋白质脱落，M13DNA及附着其上的GeneⅢ蛋白进E.coli细胞内，

↓

感染性单链DNA（正链DNA）在细菌胞内酶的作用下转变为双链DNA，称复制型DNA。

通过结构进行几轮复制。

当基因Ⅱ产物在亲代RFDNA的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即告开始。

E.coliDNA聚合酶I以环状的MB负链模板合成正链的MBDNA（pdI将单核苷酸不断加到游离的3-CH上合成（+）DNA）。

当复制叉环绕模板整整一周时，新合成的正链由基因II产物切去，经环化后形成单位长度的病毒基因组。

*1.只形成（+）DNA的原理：

当每个感染细胞中合成出200个（+）DNA时，便会产生出单链结合蛋白质。

这种蛋白质通过同（+）链DNA结合，从而阻断了（-）链DNA的合成。

*2.单链DNA结合蛋白（即GeneV产物）的功能有如下两方面：

①阻断GeneIImRNA的转译；

②与新合成的（+）DNA结合，阻止其再转变成RNA/DNA。

图M13phage在感染的E.coliCell内的复制过程，前四步发生在感染后的15-20分钟。

导致每个寄主细胞内积累100-200个环状RFDNA分子，随后持续产生单链（+）DNA并形成子代病毒颗粒。

因此在感染的细胞内，RFDNA的分子数目和子代（+）DNA的产生速率都能够保持适度。

D．异常的形态发生（大的克隆能力）

与大多数其他细菌病毒不同，M13并不是在细胞内组装成噬菌体颗粒，而是在GeneV蛋白-DNA复制物移动至细菌细胞膜的同时，GeneV产物从正链上脱落，而病毒的基因组从感染细胞的细胞膜上溢出时被衣壳蛋白所包被。

由于病毒基因组并不需要导入一个预先形成的结构之中，因此，对于可被包装的单链DNA的大小并无严格限制。

E．M13是非溶菌的，因此不会形成真正的噬菌斑，实验中所见到的M13噬菌斑乃是由于感染细胞生长缓慢所致，其生长速率通常只为正常生长速率的1/2-3/4。

每个感染细胞每个世代可产生数百颗粒，因此培养基内可聚集大量的病毒颗粒，其效价可达1012pfu/ml。

1．M13克隆体系

A．M13mp载体系列是Messingetal.,构建的。

这个载体系列都是从同一个重组M13噬菌体M13mp1改造而来。

M13mp1在其主要基因的间隔区插入了一段带有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列及其N端头146个氨基酸的编码信息。

B．M13克隆体系的寄主菌

寄主菌的F因子含有缺陷型的-半乳糖苷酶基因，它所编码的多肽没有活性，并缺失第11-41位氨基酸。

这种寄主菌当其感染了没有外源DNA插入的M13时，在感染细胞中产生的-半乳糖苷酶N端片段与寄主F因子产生的缺陷型的-半乳糖苷酶结合后，可形成具酶活性的蛋白。

*M13噬菌体之寄主菌株

应用M13噬菌体载体进行克隆时的寄主菌株有：

JM101，JM105，JM107，JM109，JM110，TG1，TG2，XL1-Blue，XS127，XS101，71/18，KK2186，MV1184，（FromSomebrooketal.,1989.P.211）

2．M13克隆体系-半乳糖苷酶显色反应原理

*M13和相关寄主菌株如JM101。

由于它们单独均不能产生有功能活性的-半乳糖苷酶，因此单独均不能显色。

只有当M13phage载体和JM101一类菌株一道才能产生完全的有功能活性的-半乳糖苷酶，因此可以显色。

A．X-gal显色反应原理

具功能活性的-lac是以四聚体形式存在的，它可将无色的底物X-gal：

（X-gal:

吡喃半乳糖苷衍生物）

5-bromo-4chloro-3-indolyl--D-galactoside

（5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）

切成半乳糖和深蓝色的底物-靛蓝：

5-bromo-4-chloroindigo

因此，X-gal可以作为检测-半乳糖苷酶活性的一种有效的指示剂。

B．顺反子内互补作用或-互补作用

推理：

*使M13体系显色最简单的办法是使之带上一个完整的lac操纵子，但这样的结果会使M13分子过大而不便于克隆操作。

*所以，应用DNA重组技术构建出只具-半乳糖苷酶基因一小部分的M13派生载体。

这个片段编码-半乳糖苷酶的氨基末端，即-肽链。

*通过顺反子内互补测验（intracistroniccomplementationtest）便可检测出这种肽链的功能活性。

定义：

所谓顺反子内互补作用，是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。

举例：

两个lac操纵子突变体：

一个在染色体上Lac-

一个在F质粒上Lac-

当两者同处一个细胞内（部分二倍体），两个lac突变体互补了，形成Lac+

互补作用：

顺反子互补也可以多肽形式出现，例如M13克隆体系就是一个典型的例子。

Lac缺失突变lacZ（M13）简称M15

合成一种缺失了11-41氨基酸的缺陷性的-半乳糖苷酶，又称M15多肽。

这段缺失使该酶失去了四聚化作用的能力。

遗传标记lacZM15：

缺失突变体，缺失lacZ基因中的-半乳糖苷酶N端部分编码序列。

M15所表达的小肽可以参与互补。

M13phage的许多寄主菌所携带的F附加体都有这种缺失的lacZ基因变种。

但是，在体外加入野生型的-半乳糖苷酶的溴化氰片段（cyanogensbromidefragment）（2-92氨基酸）就可以使M15多肽的活性得以恢复，重新获得形成四聚体的能力。

因此说溴化氰自然补偿了lacZ基因的M15突变，这种作用叫做-互补作用：

其中M15蛋白质多肽叫-受体

溴化氰片段叫-给体

M13-JM101互补作用：

实验发现，用一种特定的-半乳糖苷酶的HindII片段代替溴化氰片段，同样也可以发生-互补。

在M13-JM101克隆体系中；

M13噬菌体载体具有lacHindII片段，

JM101F质粒具有M15突变基因。

所以M13-JM101是可以实现-互补作用的；

可形成具功能活性的-半乳糖苷酶。

克隆基因活性的调节：

M13载体所携带的HindII片段上具有：

lacI

lac启动子（P）

lac操纵位点（O）

lacZ（-肽链）

4个组成部分，简称lacZOPI片段。

*HindII片段=lacZOPI片段

*由上述可见M13-HindII片段上不带有功能性的阻遏基因。

所以在被感染的细胞中，-半乳糖苷酶的合成将是组成型的：

因为当M13噬菌体颗粒感染了E.coli细胞之后，很快就会累积约200个RFDNA/cell；

假若其上带有HindII片段，那么普通的lac+细胞的阻遏状态将会随着HindII片段的复制而得以消除；

这是因为每个细胞中都仅存有10个左右的阻遏物分子的缘故。

结果在感染的细胞中，lac结构基因的转录活动便属于组成型的。

*从组成型到诱导型的改造

为了克服这种组成性，已将lac阻遏基因的Iq突变引入寄主细胞。

这个Iq突变基因可以产生出十余倍超量的阻遏物，所以这种突变的存在，寄主细胞就能合成出充足的阻遏物去补偿大量的M13RFDNA分子。

在具有lacIq突变基因的寄主细胞中，给lac操纵子加入一种诱导物，典型的是IPTG，就可以激活HindII片段的复制。

IPTG分子结构式

IPTG的作用：

*是一种含硫的乳糖类似物。

IPTG：

isopropylthio--D-galactoside异丙基硫代--D-半乳糖苷。

*这种类似物在没有乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成-半乳糖苷酶。

所以我们称IPTG为-半乳糖苷酶的安慰诱导物（gratuitousinducer），亦即不发生代谢变化的诱导物。

*在X-gal显色反应中，-半乳糖苷酶同样也需要诱导，但X-gal不是一种诱导物，所以得在琼脂平板上加入IPTG。

JM101寄主菌株（及其它类似菌株）：

在M13克隆体系中常用JM101菌株作寄主，该菌株染色体上的lacZ基因已经缺失了，但在它携带的F质粒上有一个M15基因和lacIq突变，这有两个方面的作用：

*第一，可以产生出超量的lac阻遏物，这就使得lac操纵子的表达置于培养基中渗入的IPTG的调控之下。

*第二，当M13载体感染之后，通过-互补作用，便会形成有功能活性的-半乳糖苷酶。

在补加X-gal及IPTG的培养基中，就会出现蓝色的菌落。

3．M13载体系列的发展

M13噬菌体要发展成克隆载体。

着选必须鉴定出可用来克隆外源DNA的非必要区段，然而它似乎不存在这种区段。

*特殊区段的发现——M13唯一的基因间区段的发现。

该区段位于Gene2和Gene4之间，长507核苷酸，（5498-6005）

该区段上存在着M13DNA复制起点，但就噬菌体的发育功能而言，并不要求保持该区段的完整性。

*M13mp1载体的获得

在M13唯一的基因间区段内有一个BsuI位点，将乳糖操纵子的HindII片段克隆在该位点上，获得了M13mp1载体。

M13载体系列命名为MBmpn。

其中n为整数，如M13mp8，M13mp9等。

*M13mp2载体的获得——EcoRI位点的引入

M13mp1载体的获得在M13载体发展工作中占有十分重要的地位，随后出现的一系列M13载体都是在它的基础上经改建派生出来。

该载体缺点是克隆位点少，只有AvaII、BglII和PvuI三个单克隆位点。

因此改建的重点是增加克隆位点。

在M13mp1的-半乳糖苷酶-肽链的第五个氨基酸密码子及其附近有一段GGATTC序列。

经突变获得GAATTC，即EcoRI识别序列。

（G→A碱基转换过程。

见P.185-186）

*M13mp7载体的获得——衔接物多克隆位点的引入

把化学合成的衔接物加入到M13mp2克隆载体的EcoRI位点上，产生出了适用于多种核酸内切限制酶的单克隆位点的新的M13系列克隆载体，即M13mp7。

但这段寡核苷酸短片段（即衔接物）的加入，总共为-半乳糖苷酶基因增加了14个额外密码子，然而这并不影响此多肽进行互补作用的功能。

*限制位点非对称排列的多聚衔接物的引入

M13mp7载体带有一段由非对称排列的多种限制位点组成的多聚衔接物区域：

图

这种结构的一个明显缺点是当用两种限制酶（例如EcoRI-SalI）切割时，将会产生出一种具有由远端限制酶（EcoRI）所形成的相同限制末端的载体。

这样的载体是不能克隆由同一对限制酶所产生的具不同限制末端的外源DNA片段。

根据这一问题Norranderetal.引入一段限制位点非对称排列的多聚衔接物至M13克隆载体上，其优点是：

a.可用来克隆不同限制末端的外源片段；

b.克隆片段的插入方向也是固定的；

M13mp8与M13mp9以及M13mp18和M13mp19这两对载体上，有一段结构相同但取向相反的多聚衔接物区。

这意味着

①应用这种成对M13mp载体，任何可克隆其上的外源DNA片段，均可按两种相对的取向插入。

这对于DNA测序十分有用，可以从双链测定得到相互印证的资料。

②可用来制备与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针；

4．M13载体系列的优点

a.可以十分方便地分离任何特定的单链DNA序列，克隆在M13RFDNA分子上的外源DNA片段，到了子代噬菌体便形成单链形式，故可制备单链DNA。

b.重组子化学检测

M13载体上有一条饰变的-半乳糖苷酶基因片段，可以与相应寄主产生-互补作用，形成有活性的-半乳糖苷酶，故可用X-gal及IPTG进行组织化学检测筛选重组体分子。

c.lacZ基因上具有一段多克隆序列

因此便于外源DNA片段的插入与克隆

d.定向克隆

在M13mp克隆载体上的多克隆位点的顺序是已知的，因此经两种不同限制酶消化的DNA的插入方向，便可据判断出来。

1．噬菌体展法载体的构建原理

*1丝将噬菌体，诸如M13、fd和f1，它们的分子量为6408核苷酸，共编码10种蛋白质。

其中与噬菌体展示有关的基因有如下两种：

a.GeneⅧ（g8）：

该基因编码主要外壳蛋白质cpⅧ（majorcoatprotein），其C端与DNA结合，其N端游离于噬菌体之外，拷贝数约为2700；

b.GeneⅢ（g3）：

该基因编码次要外壳蛋白质cpⅢ（minorcoatprotein），其C端固定在外壳上，N端暴露在病毒颗粒的表面上，拷贝数约为3-5个；

*2当外源基因插入到噬菌体基因组之基因Ⅷ或基因Ⅲ的3端时，外源蛋白质或多肽，便会以融合蛋白质的形式表达，融合在外壳蛋白N端的外源多肽（或蛋白质）便被展示在噬菌体颗粒的表面上。

根据这种事实，1985年G.P.Smith建立了一种专门在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多肽的所谓噬菌体表面展示技术（phagedisplay），称为噬菌体展示技术。

2．噬菌体展示载体（phagedisplayvectors）

*1定义：

根据在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多肽的噬菌体表面展示技术，发展出来的一类具有特殊用途的噬菌体载体叫做噬菌体展示载体。

当外源基因插入在该载体的GeneⅢ或GeneⅧ编码序列中，并在两者保持正确读码结构的情况下，就会产生出融合蛋白质。

简言之，根据噬菌体展示原理，在丝状噬菌体的基础上建立起来一类具有特殊用途的、可在其表面表达克隆的外源基因之编码蛋白质的噬菌体载体叫做噬菌体展示载体。

*2GeneⅢ和GeneⅧ的比较

大多数研究工作者都是用GeneⅢ作为展示外源蛋白质的噬菌体表达载体基因。

它可融合较大分子量的外基因，但其拷贝数只有3-5，远远低于GeneⅧ，更适合于展示配体受体向亲和力低的蛋白质或多肽。

而GeneⅧ则用来筛选高亲和力的配体。

*3丝状噬菌体是理想的噬菌体表面展示载体

这类噬菌体具有分子量小，易于操作等特点，是目前得到应用的理想噬菌体展示载体。

T4噬菌体和噬菌体的展示系统到目前还没得到成功应用，有待改进。

3．噬菌体表面展示文库

噬菌体表面展示技术，在许多基础研究和应用研究中都有广泛的用途噬菌体表面展示文库就是一个突出的例子。

a.体外重组将随机的多肽DNA弹夹（randompeptideDNAcassette）克隆在噬菌体展示载体的GeneⅢ编码序列中。

b.感染将以上重组的噬菌体展示载体感染雄性的大肠杆菌细胞

c.随机多肽库感染的结果，在寄主细胞中重组的噬菌体展示载体颗粒的表面，展现出各种不同的蛋白质和多肽。

此即是通常所说的随机多肽库。

d.亲和层析通过亲和层析处理，将所要分离的某种特定的目标噬菌体（例如展示具有抗体结合特性的多肽的噬菌体颗粒）分离出来。

4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例

——hGH变体的分离

应用噬菌体展示载体和展示文库技术，已经分离到大量的随机多肽，以及人生长激素变体（hGHvariants）。

下面简述应用噬菌体展示载体及展示文库技术分离人生长激素变体的简单过程：

hGH变体=人生长激素变体

a.cDNA文库构建：

构建随机突变的hGHcDNA文库

b.噬菌体文库构建：

将此hGHcDNA文库同一种以M13为基础的噬菌体展示载体连接：

于是hGH便与M13

GeneⅢ蛋白质的氨基末端结构域融合；

基因Ⅲ蛋白质的羧基末端同噬菌体颗粒结合，而带有hGH变体的氨基末端则被展示在噬菌体的外表面上；

c.转化：

把噬菌体文库导入大肠杆菌细胞，并涂布在含氨苄青霉素的培养基平板上，

d.菌落筛选：

抗性菌落的筛选

e.噬菌体颗粒诱导：

用辅助噬菌体感染这些抗性菌落的大肠杆菌细胞，以诱导产生噬菌体颗粒，

其中有1%-10%的噬菌体颗粒含有hGH-GeneⅢ融合蛋白质。

而且每个噬菌体表面都只展示一个这样的蛋白质分子。

f.hGH受体层析柱的制备：

用同hGH受体共价结合的塑料小珠装填层析柱。

g.过hGH受体层析柱：

结果：

在hGH-噬菌体过柱时，只有展示hGH的被结合在柱中，而没有展示hGH的则过柱流出。

h.分离hGH变体：

洗脱同hGH受体结合的hGH-噬菌体

再感染-再过柱-再感染-再过柱，最终得到hGH受体。

四、噬菌粒（phagemid）载体

1．M13噬菌体载体克隆的若干疑难问题

a.遗传稳定性下隆

克隆在M13噬菌体载体间隔区的外源DNA有不稳定的趋向。

克隆的外源DNA片段越大，这种缺失突变率越高。

带有大片段外源DNA的重组噬菌体，其生长速度总是要比具小片段插入的缓慢得多。

因此当外源DNA插入片段发生部分缺失之后，在强大的选择压力作用下，结果经过连续传代之后，在细菌群体中，含有原来重组噬菌体的细胞比例便被相对地稀释掉了。

b.外源DNA总是以单向插入

在实验中经常看到，尽管外源DNA片段可以双向（正、反）插入到M13克隆载体上，但在实际中观察到特定的外源DNA片段总是更容易地以其中的一个方向插入到M13克隆载体上。

其原因是：

外源DNA另一条链上的序列会不同程度地干扰M13克隆载体基因间隔区的功能。

c.克隆能力有限

一般说来，最大值克隆能力为1.5kb，偶尔亦有3kb的报导。

2．噬菌粒（phagemid）

a.定义：

这是一类由部分质粒载体和部分单链噬菌体载体结合而成具有双功能的新型载体系列，它们都具有两个复制起点，其一来自ColE1，其二来自单链DNA噬菌体f1。

b.组成部分：

在最简单的情况下，噬菌粒由如下部分构成：

质粒部分：

a.ColE1复制起点；

b.抗菌素抗性记号；

噬菌体部分：

c.噬菌体DNA复制起点与终点；

d.噬菌体形态发生有关的序列；

c.噬菌粒优点：

1克隆在phagemid上的外源DNA可以像质粒一样按常规方法增殖，形成双链DNA，既稳定又高产，具有常规质粒特性；

2复制方式可以被改变，从而产生单链DNA

当带有噬菌粒的大肠杆菌细胞被适当的丝状噬菌体感染之后，在噬菌体GeneII蛋白质影响下，噬菌粒的复制方式发生改变。

GeneII蛋白质与噬菌粒的基因间隔区相互作用，启动滚环复制，产生单链DNA拷贝。

这些单链的噬菌粒的DNA经切割形成切口，然后环化，并被包装进子代噬菌体颗粒中去。

可从这些子代噬菌体颗粒中提取单链DNA用作：

a.用作模板以测定外源DNA区段的单链核苷酸序列；

b.进行寡核苷酸定点突变；

c.合成单链特异的DNA探针。

③不必进行亚克隆即可进行测序（见②-a）

可直接进行克隆DNA片段的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体这一既繁琐又费时的亚克隆步骤。

④可产生大片段外源单链DNA（可得到较长的外源DNA之单链序列）由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA的单链序列。

3．若干常用的噬菌粒载体

用来自不同丝状噬菌体的基因间隔区插入不同的质粒中，已获得一批噬菌粒。

（目前还构建成了一批更加复杂的噬菌粒系统）。

若干常用的噬菌粒的基本特征及其寄主菌株列于下表之中。

常用噬菌粒特征一览表

质粒

基因间隔区

辅助病毒

寄主菌株

pEMBL（FrompUC8

f1

IR1,f1的一种抗干扰变异株

71/18

pBR322

M13

野生型M13噬菌体

KK2186

pRSA101（FromVX

一种对于带M13基因间隔区的质粒所引起的干扰具有抗性的M13变异株

XS127

XS101

pUC118/pUC119（FrompUC18/pUC19

M13K07，其基因II发生突变，相应产物对克隆于pUC119/pUC118的基因间隔区的作用优于对自身间隔区的作用。

MV1184

pBluescript

M13K07

XL1-Blue

*pBluescript是一种常用的噬菌粒，它的全名称应是pBluescriptM13（+/-），或者是分开写成pBluescriptM13+、pBluescriptM13-；

它们是一对带有f1噬菌体DNA复制起点的载体。

该起点以互为相反的方向插入到含有T3和T7噬菌体启动子的一个来自pUC19质粒的载体当中。

4．PBluescript噬菌粒载体

（1）体外转录载体：

将T3、T7或SP60噬菌体的启动子，组入到噬菌粒载体多克隆位点区（MCS）的两侧，便构成了一类新型的噬菌粒载体，叫体外转录载体。

a.有一类噬菌体（如T3、T7及沙门氏菌的SP6等）具有编码自身RNA聚合酶基因

此类phageRNA聚合酶基因的转录活性是由寄主RNA聚合酶控制的。

b.但是，噬菌体晚期蛋白质“或是子代噬菌体的结构组份，则是由噬菌体基因编码的。

此类噬菌体基因的转录活性是由噬菌体自身的RNA聚合酶控制的。

c.噬菌体RNA聚合酶的活性效应具有高度的专一性，只能转录具有噬菌体待定启动子的基因。

而且每一种此类噬菌体的RNA聚合酶所识别的自身启动子也是高度特异的。

由于上述这三种原因，所以将T3、T7或SP6噬菌体的启动子序列组入到噬菌体载体的多克隆位点区（MCS）的两侧，便构成了一类新型的噬菌粒载体，特称为体外转录载体（invitrotranscriptionvectors）。

在体外系统中，加入适