猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较.docx
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猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较
猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较
试验方案
猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较
参考编号
试验的日期
动物试验
开始日期
2014--
动物试验
完成日期
2014--
实验室试验
开始日期
2014--
实验室试验
完成日期
2014--
动物试验
地点
实验室试验地点
江苏省农科院兽医所
试验负责人
邵国青
动物试验
负责人
冯志新、熊祺琰、华利忠
动物试验参与者
甘源、王佳、徐飞扬、陈财
实验室试验
负责人
冯志新、熊祺琰、华利忠
实验室实验参与者：
冯志新、熊祺琰、马庆红、陈财、王佳
试验方案起草人
冯志新、熊祺琰、华利忠
试验方案讨论参加者
邵国青、刘茂军、冯志新、熊祺琰
试验方案定稿人及时间
2014-
记录的附件页数
猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较1
猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较1
目录2
猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较3
1目的3
2材料与方法3
2.1材料3
2.2方法4
2.2.1动物分组说明4
2.2.2动物分组与试验操作概表5
2.2.3免疫6
2.2.4疫苗免疫后临床症状观察记录7
2.2.5疫苗免疫后血清抗体及分型检测7
2.2.6疫苗免疫后细胞免疫指标检测7
2.2.7疫苗免疫后黏膜免疫指标检测7
2.2.8攻毒7
附录1攻毒保护率计算9
附录2猪支原体肺炎发病猪临床症状评判标准10
附录3动物分组记录表11
附录4动物免疫记录表12
附录5免疫后异常临床症状观察记录表13
附录6抗体检测记录表14
附录7淋巴细胞增殖试验结果16
附录8血象分析17
附录9T淋巴细胞分类计数18
附录10黏膜抗体检测记录表19
附录11攻毒记录单20
附录12特殊情况记录表21
附录13攻毒后临床症状观察记录表22
附录14日增重记录24
附录15攻毒后肺部剖检记录26
附录16攻毒后剖检记录28
附录17攻毒后肺部病理损伤记录30
附录18攻毒后肺部猪肺炎支原体抗原定量检测32
猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较
1目的
猪支原体肺炎活疫苗AN306菌株与原168菌株的肺内注射免疫效果比较；
猪支原体肺炎疫苗（天邦、吉林正业、辉瑞）免疫效果比较；
2材料与方法
2.1材料
2.1.1待试的疫苗产品与试剂
2.1.1.1疫苗
A.猪支原体肺炎活疫苗AN306株F321，由江苏省农业科学院兽医所研制，规格为2×107CCU/瓶（2ml冻干），批号为20140325。
有效期：
______。
PCR鉴定:
Mhp_____，Mhr_______。
B.猪支原体肺炎活疫苗（168株），由南京天邦生物科技有限公司提供，规格为50头份/瓶，批号为139078-1。
有效期：
______。
PCR鉴定:
Mhp_____，Mhr_______。
C.猪支原体肺炎活疫苗（乳兔继代株），由吉林正业生物科技有限公司提供，规格为4头份/瓶，批号为2014002。
有效期：
___
D.猪支原体肺炎灭活疫苗（P-5722-3株，SuvaxynRespiFendMH），由上海硕腾（辉瑞）提供，规格为50头份/瓶，批号为1302777A。
有效期：
15/11/16_
2.1.1.2试剂
A．猪支原体肺炎活疫苗（乳兔继代株）稀释液,批号：
2014002；有效期：
20170115
B．猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液
C．猪支原体肺炎肌注活疫苗佐剂G-1-1
2.1.2动物
选择猪肺炎支原体抗体、抗原均阴性的5-10日龄仔猪，54头.
饲养地点：
江苏省农科院兽医所
饲养员：
_徐飞扬，陈才__
仔猪免疫状况：
未打气喘病疫苗。
2.1.3动物饲料
仔猪料:
2.1.4设备
气雾免疫设备、滴鼻头、20（10、5、2）ml注射器、耳标、耳号钳、冰盒、相机、解剖器械、离心管。
2.1.5攻毒用强毒
猪肺炎支原体强毒JS株组织强毒，来自本所，批号20130625，-20℃保存，有效期至：
2014/06/25。
2.2方法
2.2.1动物分组说明
G1:
-猪支原体肺炎活疫苗168株肺内免疫组。
每头猪肺内注射免疫1头份（1ml）即1×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。
免疫一次，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。
G2:
-猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺内免疫组。
每头猪肺内注射免疫1ml，即1×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗AN306株。
免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。
G3:
-猪支原体肺炎活疫苗168株气雾免疫组。
每头猪气雾免疫5×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。
免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。
G4:
-猪支原体肺炎活疫苗168株肌注免疫组。
每头猪肌肉注射免疫5×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。
首免后两周二免，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。
G5:
-猪支原体肺炎灭活疫苗肌注免疫组。
每头猪肌肉注射免疫1头份（2ml）猪支原体肺炎灭活疫苗。
首后2周，加强免疫一次，首免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。
G6:
-猪支原体肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫组。
每头猪胸腔注射免疫1头份（5ml）猪支原体肺炎乳兔活疫苗。
免疫一次，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。
G7:
-猪支原体肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫组。
每头猪滴鼻免疫？
头份猪支原体肺炎乳兔活疫苗。
免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。
G8:
-健康对照组（不免疫，不攻毒）。
不接种疫苗。
不攻毒，其它组攻毒后28天剖杀。
G9:
攻毒对照组（不免疫，只攻毒）。
不免疫疫苗，只攻毒，攻毒后28天剖杀。
2.2.2动物分组与试验操作概表
组号
组别
N
疫苗
剂量
DPI-0
DPI-7
DPI-14
DPI-21
DPI-28
DPI-35
DPI-42
DPI-70
G1
168肺内组
6
天邦
1×107CCU/头（1头份）
肺内免疫/采血/鼻拭子/称重
鼻拭子
采血/鼻拭子
鼻拭子
采血/鼻拭子
鼻拭子
采血/鼻拭子/攻毒/称重
剖检/称重
G2
AN306肺内组
6
ADC
1×107CCU/头
G3
168气雾组
6
天邦
5×107CCU/头
气雾免疫/采血/鼻拭子/称重
G4
168肌注组
6
天邦
5×107CCU/头
肌注免疫/采血/鼻拭子/称重
肌注免疫/鼻拭子
采血/鼻拭子
G5
灭活苗组
6
辉瑞
2ml/1头份
G6
乳兔苗胸腔组
6
吉林正业
5ml/1头份
胸腔免疫/采血/鼻拭子/称重
采血/采血/鼻拭子
鼻拭子
G7
乳兔苗滴鼻组
6
吉林正业
1头份
滴鼻免疫/采血/鼻拭子/称重
G8
健康对照组
6
-
-
采血/鼻拭子/称重
G9
攻毒对照组
6
-
-
称重
攻毒/称重
总计
54
2.2.3免疫
G1—猪支原体肺炎活疫苗168株肺内免疫组
用灭菌生理盐水50ml溶解168活疫苗冻干粉1瓶，使活疫苗终浓度为1×107CCU/ml，1头份/ml。
每头猪肺内免疫1ml，即1×107CCU/头。
G2—猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺内免疫组
用灭菌生理盐水溶解AN306活疫苗冻干粉，使活疫苗终浓度为1×107CCU/ml。
每头猪肺内免疫1ml，即1×107CCU/头。
G3:
-猪支原体肺炎活疫苗168株气雾免疫组。
将1瓶168株活疫苗用5ml无菌猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液溶解稀释成1×108CCU/ml浓度，取5ml疫苗溶液倒入喷雾器，对保温箱中的6头仔猪进行气雾免疫（0.2MPa，约10min）。
G4:
-猪支原体肺炎活疫苗168株肌注免疫组。
将1瓶168株活疫苗用25ml佐剂G-1-1溶液稀释成2×107CCU/ml浓度，每头仔猪颈部肌肉注射免疫2.5ml，注射时分左右侧肌肉共2个注射点。
首免后14天二免，方法同上。
G5:
-猪支原体肺炎灭活疫苗肌注免疫组。
按猪支原体肺炎灭活疫苗说明书，每头猪肌肉注射免疫1头份猪支原体肺炎灭活疫苗。
G6:
-猪支原体肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫组。
按猪支原体肺炎乳兔活疫苗说明书，每头猪胸腔免疫1头份猪支原体肺炎活疫苗。
G7:
-猪支原体肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫组。
每头猪滴鼻免疫？
头份猪支原体肺炎乳兔活疫苗。
免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。
G8—健康对照
不免疫
G9—攻毒对照
不免疫
2.2.4疫苗免疫后临床症状观察记录
免疫后观察并记录可能出现的临床症状，填写附录3。
尤其要记录如下重要的症状：
咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤、死亡等
2.2.5疫苗免疫后血清抗体及分型检测
除攻毒对照组外，其余各组于免疫前、免疫后2、4、6周取3头猪各采血1ml（两次免疫组于首免前、首免后3、4、6周采血），分离血清，用自制P46-ELISA试剂盒检测IgG抗体。
对于阳性者继续用分型试剂盒检测IgG亚类。
2.2.6疫苗免疫后细胞免疫指标检测
除攻毒对照组外，其余各组于首免后2、4、6周取3头猪各采集抗凝血5ml（两次免疫组于免疫后3、4、6周采血），其中1ml用于血液生化检测；1ml用流式细胞仪检测CD4+T细胞、CD8+T细胞含量、CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+/CD8+比率；另外3ml用于淋巴细胞增殖试验和IFN-γ检测
2.2.7疫苗免疫后黏膜免疫指标检测
除攻毒对照组外，其余各组于免疫前、首免后7、14、21、28、35、42天采集鼻拭子样品，检测吸呼道特异性sIgA抗体。
2.2.8攻毒
将每瓶猪肺炎支原体组织强毒用50ml生理盐水稀释，气管途径接种试验组试验猪，每头5ml。
2.2.9攻毒后临床症状观察
所有猪在攻毒后按附录2要求观察临床症状
2.2.10日增重计算
各组分别选定3头猪，不采集血样，分别于首免当天、攻毒当天和剖杀当天称重，计算日增重。
2.2.11攻毒后肉眼病变剖检
所有仔猪在攻毒后的第28天进行宰杀，记录肺病变，用28分法统计确定肺病变程度，并记算攻毒保护率（见附录1）。
2.2.12攻毒后病理损伤观察
剖杀后，采集所有猪左尖叶，福尔马列林溶液固定后，切片观察病理损伤。
2.2.13攻毒后肺部猪肺炎支原体抗原定量检测
剖杀后，每头猪用50ml生理盐水采集肺泡灌洗液，用定量PCR方法检测猪肺炎支原体抗原。
附录1攻毒保护率计算
攻毒保护率的统计与评判：
试验猪扑杀后，分别记录左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶、副叶病变百分比率，将0～25%记为1；26～50%记为2；51～75%记为3；76～100%记为4，统计每个试验猪病肺病变指数（最高为28）。
试验猪病变指数大于10判为发病，小于4为健康（排除猪肺炎支原体感染），根据肺病变指数，按以下公式计算试验猪攻毒保护指数。
试验猪攻毒保护指数＝（攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值－试验猪肺病变指数）/（攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值－不攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值）％
试验猪攻毒保护指数小于60％为无保护，大于或等于60％为有保护，再按以下公式计算试验猪攻毒保护率。
试验猪攻毒保护率＝有保护试验猪数/试验猪数
试验在阳性对照组全部发病、阴性对照组至少全部健康时有效。
附录2猪支原体肺炎发病猪临床症状评判标准
评判参数
0
1
2
10
最高分
咳嗽
无
有
严重
2
呼吸困难
无
有
严重
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