婴幼儿配方食品和乳粉Word下载.docx
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在以后的5年中，婴幼儿配方乳粉生产使用核苷酸的企业数量剧增，目前有90%以上的企业都作为营养成分之一添加核苷酸。
作为检测机构急需建立才完善的检测方法并尽快申报国家标准已成为当务之急。
基于这种情况，我们又在2006年专门组织技术人员成立研究小组对原来的检测方法研究进行了分析，从而找出原方法的缺陷，同时通过各种途径收集相关技术资料，制定了进一步开展研究的技术路线。
因原方法中采用的是缓冲盐作为流动相，且5个组分须采用不同的流动相分两次进行测定，其方法较为繁琐，若制定为国家标准明显不符合要求。
为此我们通过论证决定采用离子对色谱法一次同时测定5个组分的技术路线展开研究，并于2006年底初步完成了乳制品中核苷酸检测技术的研究工作。
自2007年为进一步完善该技术，我们又与南京工业大学国家生化工程技术研究中心下属专业生产核苷酸的产业基地—南京同凯兆业生物技术有限责任公司合作，利用他们的技术优势，共同对该检测技术进一步实验研究，通过了大量实验建立了高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸的方法。
为将该方法能及时上升为国家标准，解决乳制品中核苷酸的检测及在婴幼儿配方乳粉等办证件检验有据可依等问题，我们通过全国乳品标准化中心向国家标委会提出立项的申请，并于2007年批准。
随后我们共同组织了标准起草小组，开展了按照国家标准制定的要求对方法的适用范围、采用的标准、验证方法、准确性、精密度等方面进行了分析和确认，并于2007年底基本完成了实验室验证工作。
通过验证后认为此方法操作简单、准确、快速，基本符合制定国家标准的条件。
3.2实验室间验证工作
2008年6月全国乳品标准化中心在青岛组织召开了乳品系列标准的制修订工作研讨会。
会上我们提交了由国家乳制品质量监督检验中心与南京同凯兆业生物技术有限责任公司共同起草的标准讨论稿，并对该标准进行了详细的介绍。
会上一致通过了该标准讨论稿并同意进行方法验证。
根据会议精神，我们邀请了通过CNAS认可的实验室美赞臣（广州）有限公司、上海英特尔营养乳品有限公司、内蒙古蒙牛乳业集团股份有限公司等单位与我中心共同进行了实验室间的方法验证工作。
通过统计分析各实验室提交的检测数据，验证了该方法的精密度等。
参加验证的实验室一致认为：
该方法用于测定以婴幼儿配方乳粉类产品为主的样品中核苷酸的含量，具有测定结果准确可靠，操作简单、快速等特点。
4.制定标准的原则和依据。
目前报道的检测方法主要有微生物法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等，对于核苷酸的仪器分析报道较多，多用ODS反相色谱柱，通常采用是离子对反相色谱法。
但都不适合乳品中核苷酸的测定，本研究就是在收集有关资料的基础上，结合乳制品样品的特点，选择离子对反相色谱法进行研究，建立了高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸的简便、准确的检验方法。
经实验验证：
该方法的准确性、重现性、检出限等完全能满足婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸含量测定的要求。
5标准主要条款的说明
5.1标准名称
本标准的名称定为：
《婴幼儿配方食品和乳粉核苷酸的测定》。
5.2范围
本标准适用于婴幼儿配方食品、乳粉中五种核苷酸的测定。
（胞嘧啶核苷酸CMP、尿嘧啶核苷酸UMP、腺嘌呤核苷酸AMP、鸟嘌呤核苷酸GMP、次黄嘌呤核苷酸IMP）
5.3样品的处理方法的研究
样品的处理主要考虑的是既能将样品中的蛋白质分离出去，又能将核苷酸无损失的提取出来。
为此我们将样品用水溶解，通过超声波振荡后采用3种样品处理方式来沉淀蛋白质：
10%乙酸、调pH值及0.33mol/L的高氯酸。
10%乙酸沉淀蛋白和高氯酸沉淀蛋白质的方法是将充分振荡溶解的样品转入50mL容量瓶中，加入5mL10%乙酸或0.33mol/L的高氯酸溶液，定容，充分混匀后用滤纸过滤；
调pH法沉淀蛋白质的方法是先用稀盐酸溶液将充分振荡溶解的样品溶液的pH调至1.7，静止1min后再用氢氧化钠调pH到4.5，转入50ml容量瓶中定容，混匀，用滤纸过滤。
上述滤液通过0.45µ
m的滤膜过滤后上机测定。
通过对测定色谱图进行分析后发现：
上述3种处理方式对色谱图中杂质峰的数量和色谱峰形及分离度都有有一定的影响：
调pH沉淀蛋白质的试液杂质峰要多于用乙酸沉淀蛋白质的方法。
使用高氯酸沉淀蛋白和乙酸沉淀蛋白效果相近，但用乙酸沉淀时色谱峰形最好，而且方便。
根据上述处理样品方法的比较，确定采用10%乙酸沉淀蛋白质的样品处理方法。
5.4色谱柱及条件的选择
5.4.1色谱柱的选择：
色谱柱性能是待测物能否达到理想的分离度、方法成功的关键之一。
由于核苷酸为离子型化合物，采用离子对色谱进行各组分的分离可能会得到理想的结果。
在色谱柱的选择上，我们先后采用了AichromBond-AQC18柱、SUPELCOSILLC-18-TC18柱和氨基柱waters三种色谱柱进行实验。
结果发现：
使用氨基柱时，GMP和IMP完全重叠在一起，没有分开，所有组分在10min左右全部流出；
使用AichromBond-AQC18柱时，由于流动相的细微变化，其中GMP和IMP有时重叠在一起，有时分离度较差，较难分离；
而SUPELCOSILLC-18-T可以使五种核苷酸都得到较好的分离。
SUPELCOSILLC-18-T柱添料的硅表面经过特殊的处理，与普通的C18柱相比，它可以减少硅烷醇和核苷酸之间的相互作用，提高分析的灵敏度，因此我们选用SUPELCOSILLC-18-T柱进行测定。
5.4.2流动相的选择
我们主要对流动相进行了优化，即离子对试剂的浓度、流动相pH值和甲醇浓度进行优化。
5.4.2.1离子对试剂的浓度
我们选用离子对试剂四丁基硫酸氢铵的浓度分别为1.30mmol/L、1.40mmol/L、1.50mmol/L、1.70mmol/L、1.75mmol/L、和2.0mmol/L。
由试验结果可以看出离子对试剂浓度变化对核苷酸的出峰顺序、分离效果及峰形影响很大：
当四丁基硫酸氢铵浓度为1.40mmol/L时，分离效果最好，基线分离，峰形对称，且样品中的核苷酸与杂质峰完全分开，色谱峰的顺序为CMP、AMP、UMP、GMP和IMP。
因此我们选用离子对试剂的浓度为1.40mmol/L。
5.4.2.2流动相pH值的选择
考虑到核苷酸的水溶液在酸性环境中比较稳定，选择调节流动相的pH值为酸性。
对pH值在4.5～6.0之间进行实验，经过采用不同pH值的试验证明：
pH为5.0时，核苷酸的五个色谱峰能够完全分开，灵敏度比较高，最终确定选择pH为5.0。
实验表明pH值对色谱峰的分离有很大的影响，因此调流动相pH时，一定要精确。
5.4.2.3甲醇体积分数
在确定离子对试剂的浓度（1.40mmol/L）和流动相的pH值（5.0）后，又对含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为100：
0、100：
1、100：
2.5、100：
4、100：
5和100：
10的流动相进行实验。
实验表明：
加入甲醇的体积对五个组分峰的保留时间影响较大，而且对五个组分峰影响的程度不一样，并直接影响出峰顺序及分离度。
结果表明含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为100：
4的流动相效果更好。
经过实验最终决定采用含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为100：
4的溶液作为流动相。
标准及奶粉核苷酸色谱图
图1五种标样色谱图
图2样品与样品加标样色谱图
5.5标准曲线的绘制
将核苷酸标准溶液稀释成不同浓度的标准系列，分别用不同浓度的标准溶液进样，以浓度为横坐标，峰高均值为纵坐标，绘制标准工作曲线，通过回归计算求得回归方程和相关系数，可见在一定浓度范围内浓度与峰高间呈正相关，相关性好，可用于外标法进行定量测定。
见下表1：
表1核苷酸标准系列浓度及峰高间回归方程与相关系数
核苷酸
浓度1
浓度2
浓度3
浓度4
浓度5
回归方程
相关系数r
CMP
浓度µ
g/mL
7.55
15.1
30.2
60.4
120.8
y=801.28x+371.33
0.9999
峰高
6171
12258
24970
49010
96988
AMP
6.65
13.3
26.6
53.2
106.4
y=676.87x-102.08
1.0000
4387
8824
17948
35996
71872
UMP
9.5
19.0
38.0
76.0
152.0
y=564.21x-214.13.
5229
10433
21175
42713
85538
GMP
3.5
7.0
14.0
28.0
56.0
y=554.97x+66.125
1934
3841
7834
15940
30996
IMP
y=401.44x-87.708
1335
2714
5524
11147
22398
5.6分析结果的计算
液相色谱法测定样品中核苷酸含量采用在一定浓度的范围内符合比尔定律的原理，通过绘制标准回归曲线的方式，查出样品待测液中核苷酸的浓度，从而计算出样品中的含量。
对于高含量的样品，可通过取样量等方法将核苷酸的浓度控制在适当的范围，保证测定液中核苷酸的浓度在线性范围内。
5.7线性范围
为了确定本标准适用的线性区间，设计实验测定方法线性范围。
在允许的范围内，核苷酸各组分标准系列浓度分别为：
CMP0-120µ
g/mL、AMP0-100µ
g/mL、UMP0-150µ
g/Ml、GMP0-50µ
g/mL、IMP0-50µ
g/mL，经验证符合比尔定律。
在操作上直接吸取标准工作液上机，标准系列浓度测定结果及线性回归方程及相关系数见表1。
5.8最低检测限
根据GB/T5009.1-2003，中A2.1色谱法的计算方法。
计算检出限：
式中：
b－标准曲线回归方程中的斜率，响应值/µ
g或响应值/ng；
s—为仪器噪音的3倍，即仪器能辨认的最小的物质信号。
结果：
确认样品CMP检出限为1.12mg/kg。
样品UMP检出限为1.60mg/kg。
样品GMP检出限为1.62mg/kg。
样品IMP检出限为2.24mg/kg。
样品AMP检出限为1.33mg/kg。
5.9准确度
为了确定本方法的准确度,根据GB/T5009.1-2003，我们选用3个样品为试验材料，加入核苷酸混合标准溶液，按照标准讨论稿的方法进行回收率测定，每个样进行四次重复，测定结果见表2：
表2 回收率试验结果
项目
水平
1
2
3
平均
次数
4
本底值mg
0.874
1.6724
0.980
添加量mg
0.382
0.765
1.147
1.530
实测值mg
0.368
0.734
1.075
0.131
0.365
0.728
1.095
1.437
0.357
0.711
1.013
1.412
回收率%
96.3
96.0
93.8
85.6
95.6
95.2
95.5
93.9
93.4
92.9
88.3
92.3
93.2
0.692
0.493
0.398
0.414
0.849
1.227
1.573
0.390
0.824
1.199
1.808
0.400
0.793
1.189
1.532
108.5
111.0
107.0
102.8
102.1
107.7
104.5
118.2
104.7
103.6
103.7
100.1
106.2
0.177
0.212
0.492
0.372
0.767
1.094
1.577
0.343
0.679
1.464
0.361
1.106
1.452
97.4
100.3
95.4
103.1
89.9
88.8
95.7
94.6
93.0
96.4
94.9
94.8
0.340
0.123
0.175
0.149
0.780
1.140
1.473
0.442
0.894
1.262
1.726
0.376
0.750
1.116
1.463
102.2
101.9
99.4
95.9
115.8
116.8
110.0
112.8
98.5
98.1
97.3
0.674
0.489
0.443
0.417
0.855
1.219
1.590
0.389
0.801
1.178
1.513
0.388
0.776
1.145
109.1
111.7
106.3
103.9
101.8
102.7
98.9
101.7
101.5
99.8
103.4
5.10精密度
国家乳制品质量监督检验中心实验室内精密度见下表
重复
次数
水平1
水平2
水平3
9.21
6.32
5.38
2.56
4.43
12.50
5.64
4.89
0
3.61
21.03
8.56
6.54
2.57
4.53
8.73
5.94
5.24
2.38
4.82
12.69
5.29
4.21
3.85
19.86
8.57
6.20
2.61
4.27
10.26
5.68
5.69
2.01
4.19
13.13
5.81
4.61
3.42
20.65
9.03
6.79
2.30
4.96
9.41
6.04
5.50
3.00
4.26
12.56
6.03
5.07
3.99
20.94
9.12
5.96
2.55
4.56
5
8.72
6.73
5.87
2.97
4.93
11.92
5.67
4.99
4.03
19.65
8.66
6.38
2.47
4.58
6
9.60
6.52
5.02
2.08
4.87
12.67
5.59
4.87
3.65
19.87
2.88
4.13
7
9.27
6.19
5.39
2.53
12.34
5.27
4.66
3.84
19.64
8.23
6.55
2.66
4.28
8
8.50
6.08
5.32
2.99
4.53
12.75
5.11
4.72
3.75
20.16
8.01
2.43
4.77
平均值
5.43
4.54
12.57
5.55
4.75
3.77
20.23
8.59
6.43
4.51
标准
偏差
0.570
0.333
0.264
0.399
0.300
0.349
0.308
0.271
－
0.204
0.368
0.296
0.172
0.276
相对标准偏差（CV％）
4.86
15.54
6.62
2.77
5.54
5.70
5.40
2.82
6.12
方法验证
由我中心统一制备样品，同时发送到4个参加方法验证的实验室进行验证。
其中三个实验室对每个样品共测定8次，一个实验室对每个样品测定6次，结果见表3：
国家乳制品质量监督检验中心实验室内精密度见下表
19.56
10.85
10.57
0.27
6.92
9.50
3.16
2.80
2.33
1.16
0.21
3.39
20.22
10.67
10.44
0.25
6.74
9.45
6.27
3.19
4.47
6.72
2.76
1.34
3.31
19.75
10.43
11.01
0.15
10.10
6.78
3.35
3.18
4.73
6.58
2.71
1.79
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