生物化学笔记王镜岩Word文件下载.docx

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根据蛋白质的①溶解性质、②大小不同、③带电状态不同/电荷多少

④净化方法根据与其他化合物相互作用的蛋白质（部分蛋白质对..有特定的..）

②：

凝胶过滤层析

常用凝胶过滤介质

Sephadex：

交联葡聚糖，是采用环氧氯丙烷作交联剂将右旋葡聚糖交联而成。

干粉容易膨胀，在水、盐溶液、有机溶液、碱和弱酸中化学性质稳定，可高压灭菌。

高交联度的Sephadex，其颗粒坚硬，适于高流速下操作。

Sephacryl:

烯丙基葡聚糖同N、Nˊ—甲叉双丙烯酰胺共价交联而成。

颗粒坚硬，性质比Sephadex更为稳定，可高压灭菌，在pH3~11条件下稳定，可用有机溶剂洗脱，也可用SDS、尿素及盐酸胍洗脱。

Sepharose：

琼脂糖凝胶，是将琼脂糖溶液冷却，多糖链形成双螺旋，凝集成束，自发的形成稳定的珠状颗粒。

琼脂糖由氢键维系，在pH4~9条件下稳定，超过40℃熔化，冷冻出现珠状。

可分为Sepharose2B、4B、6B（即含琼脂2%、4%、6%）。

SepharoseCL又称交联琼脂糖，是Sepharose同2，3-二溴丙醇在强碱下交联而成。

在pH3~11条件下稳定。

SepharoseFastFlow是经过高度交联的琼脂糖珠体，大大增加了其机械强度，以流速快为特征。

由于流速快，所以工业规模使用。

有极高的物理化学稳定性，可用多种有机溶剂清洗，还可用1-2mol/L的NaOH进行“原位清洗”。

一些注意事项

1）为了提高分辨率，柱高应为柱直径的20～40倍；

2）上样量应小于柱床体积的5%，最大不应超过柱床体积的10%，上样的蛋白质样品浓度以不超过4%为宜，浑浊样品需离心后上样。

3）洗脱时，流速要恒定。

缓冲液的pH值、离子强度等必须都有利于蛋白质稳定；

中等离子强度的缓冲液有助于消除蛋白质与凝胶可能产生的相互作用；

4）Sephadex在使用前需要溶胀，一份凝胶加10份水；

在摇床上或手动混合，避免使用电力搅拌器；

待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止；

自然溶胀需24h或几天，加热可促进溶胀，1～2h即可完成；

③：

离子交换层析

离子交换层析类型

强酸型：

磺乙基、磺丙基

阳离子交换树脂中酸型：

磷酸基

弱酸型：

羧甲基

强碱型：

三乙基氨基乙基、

阴离子交换树脂二乙基（2—羟丙基）—氨基乙基

中强碱型：

二乙基氨基乙基

弱碱型：

氨基乙基、对氨基苯甲基

蛋白质纯化常用的离子交换剂

蛋白质纯化常用亲水性离子交换剂。

因为亲水性离子交换剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化的物质不易被破坏。

纤维素类：

纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离的介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优点。

但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。

DEAE-Sephacel是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。

葡聚糖系离子交换介质：

主要以Sephadex系的产品为主，它是在SephadexG25及G50两种凝胶过滤介质上引入功能基后，产生的多种离子交换介质。

该类介质容量大，价格较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代的BioProcess凝胶所代替。

琼脂糖系（agarose）：

琼脂糖凝胶介质上引入功能基得到的多种离子交换剂。

其中，新一代BioProcess系列凝胶，具有流速高，载量大，理化稳定性好，可就地清洗，并可反复使用，是目前使用最多的离子交换介质。

3.细分离

3.7AminoAcidCompositionofProteins氨基酸组成的蛋白质

朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律

在特定波长下，溶液中物质的光吸收与其浓度C（以mmol-1为单位）和溶液中光径长l（以cm为单位）成正比。

A=εCl

紫外吸收:

Trp,λ=280nm;

Tyr,λ=275nm;

Phe,λ=257nm;

3.8测蛋白质的C末端

§

1.切割位点（四种酶的酶切位点）

羧肽酶:

（1）羧肽酶劈开所有除了P,R、K（可以不做第二AAPro）;

（2）羧肽酶B劈开只有R和K（可以不做第二AAPro）;

（3）羧肽酶C劈开C末端AA,只有第二个AA是专业;

（4）羧肽酶Y劈开;

【Carboxypeptidase：

（1）CarboxypeptidaseAcleavesallexceptforP,R,K（ItcannotdoneifsecondAAisPro）;

（2）CarboxypeptidaseBcleavesonlyRandK（ItcannotdoneifsecondAAisPro）;

（3）CarboxypeptidaseCcleavestheCterminalAAthatonlysecondAAisPro;

（4）CarboxypeptidaseYcleavesall;

】

3.Cleaveeachchainintosmallerfragmentsbysite-specificproteasesorchemicals

（1）胰蛋白酶（胰酶）

Chymotrypsin：

C-terminalofPhe,Trp,Tyr.

糜蛋白酶：

C末端PheTrpTyr

（2）化学试剂

CNBR：

切割C端的甲硫氨酸

第4章、蛋白质的空间结构

4.1蛋白质的构象

二面角

4.7肌红蛋白的结构和功能

4.8血红蛋白

肌红蛋白和血红蛋白属于同源蛋白质。

（序列、功能相似相同）

肌红蛋白Mb

血红蛋白Hb

4.10Measurementofprotein（蛋白质含量的测定）

1．凯氏定氮法（Kjeldahl）

蛋白质含量＝6.25×

蛋白N含量

消化：

蛋白质+H2SO4强热和CuSO4→（NH4）2SO4+SO2↑+CO2↑+H2O

蒸馏：

（NH4）2SO4+2NaOH→Na2SO4+2H2O+2NH3↑

2NH3+4H3BO3→（NH4）2B4O7+5H2O

滴定：

（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3

2．双缩脲法（biuret）（相对灵敏度不高）

540nm

3．Follin—酚法（Lowry）

Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。

蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。

由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比（660nm）。

可测定蛋白质含量的范围：

25～250μg/mL。

干扰因素：

溶液或样品中含有带“-CO-NH2”、“-CH2-NH2”、“-CS-NH2”基团的化合物，Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时。

4．染料结合法（Bradford）

CoomassieBrilliantBlueG-250（考马斯亮蓝g-250）

5．BCA法（bicinchoninincacid）

6．紫外吸收法（最大光吸收280nm）

核酸干扰较大。

纯蛋白质：

OD280/OD260>

1.75，

纯核酸：

OD280/OD260<

0.5。

OD280=εcL，需已知ε；

蛋白质浓度（mg/mL）=OD280×

F；

用OD280/OD260查表知F因子

蛋白质浓度（mg/mL）=1.45×

OD280—0.74×

OD260；

第5章、酶

1、酶通论

不是所有的酶都是蛋白质，一些RNA分子（核酶）也是酶。

酶：

全酶（holoenzyme）：

脱辅酶与辅因子结合后所形成的复合物称为全酶。

即全酶=脱辅酶+辅因子

酶的分类：

1.氧化还原酶

2.转移酶

3.水解酶

4.裂合酶

5.异构酶

6.连接酶

酶的命名：

1.习惯命名法

1　根据酶作用的底物命名，如淀粉酶、蛋白酶，有时还加上来源以区分不停来源的同一类酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶

2　根据酶催化反应的性质及类型命名，如水解酶、转移酶、氧化酶等。

有的酶结合上述两个原则命名，如琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢反应的酶。

2.国际系统命名法

以酶所催化的整体反应为基础，规定每种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质。

如果一种酶催化两个底物起反应，应在他们的系统名称中包括两种底物的名称，并以“：

”将他们隔开。

若底物之一是水时，可将水略去不写。

酶作为生物催化剂的特点

1.酶易失活

2.酶具有很高的催化效率

3.酶具有高度专一性

4.酶活性收到调节和控制

许多酶需要帮助催化的非蛋白辅助因子

1.辅因子包括金属离子及有机化合物。

2.一些辅助因子结合酶蛋白紧密（非共价或共价）,他们因此被称为辅基（prostheticgroups）。

3.只有脱辅酶和它的辅因子的同时存在才起作用（称为全酶）。

4.辅酶在酶催化中通常是起着电子、原子或某些化学基团的传递作用。

（Coenzymesusuallyfunctionastransientcarriersofspecificfunctiongroups.）

5.维生素通常作为辅酶的前体。

热力学define反应速率和平衡

酶影响反应速率，不影响平衡

结合能导致特异性和催化反应

Bindingenergycanbeusedtoovercomethesebarriers:

1）Entropy,therelativemotionoftwomoleculesinsolution;

（entropyreduction）

2）Thesolvatedshellofhydrogen-bondedwaterthatsurroundsandhelpstostabilizemostbiomoleculesinaqueoussolution;

（desolvation）

3）Theelectronicorstructuraldistortionofsubstratesthatmustoccurinmanyreactions;

（Electronredistribution）

4）Theneedtoachieveproperalignmentofappropriatecatalyticfunctionalgroupsontheenzyme.（Inducedenzymeconformationchange）

1）降低熵值，使分子间作用时更稳定。

2）去溶剂化，使底物暴露在无水且相对稳定的环境。

3）电子在酶的催化下结构更容易变形，易进行再分配。

4）催化剂诱导酶产生形变，重排。

2、酶动力学

米氏方程及其推导和应用

（推导P357）

米氏方程：

[S]：

底物浓度

Vmax：

酶完全被底物饱和时的最大反应速率

Km：

米氏常数（

）

根据米氏方程式可以说明以下关系：

1）当[S]<

<

Km时，反应速率与底物浓度称正比，v与[S]的关系符合一级动力学。

这时由于底物浓度低，酶没有全部被底物所饱和，因此在底物浓度低的条件下是不能正确测得酶活力的。

2）当[S]>

>

Km时，反应速率已达到最大速率，这时酶全部被底物所饱和，v与[S]无关，符合零级动力学，只有在此条件下才能正确测得酶活力。

3）当[S]=Km时，反应速率为最大速率的一半。

因此Km值就代表反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。

Lineweaver—Burk双例数作图法

将米氏方程式两侧取倒数，得到下面方程式:

以

—

作图，得出一直线。

横轴截距为

，纵轴截距为

。

该作图缺点是：

实验点过分集中在直线的左下方，而低浓度S的实验点又因倒数后误差较大，往往偏离直线较远，从而影响Km和Vmax的准确测定。

稳态：

指反应进行一段时间后，系统的复合物ES浓度，由零逐渐增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度和产物浓度不断地变化，复合物ES也在不断地生成和分解，但是当反应系统中ES的生成速率和ES的分解速率相等时，络合物ES浓度保持不变的这种反应状态称为稳态，即

酶的抑制作用

通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。

抑制作用的类型

根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制作用分为两大类

1.不可逆的抑制作用

抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，称为不可逆抑制。

由于被抑制的酶分子受到不同程度的化学修饰，故不可逆抑制也就是酶的修饰抑制。

2.可逆的抑制作用

抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。

根据可逆抑制剂与底物的关系，可逆抑制作用分为三种类型（P368-369）

1）竞争性抑制

2）非竞争性抑制

3）反竞争性抑制

酶的抑制剂

竞争型抑制、非竞争型抑制、混合型抑制

酶的不可逆抑制剂

底物类似物、自杀抑制剂

三．酶的作用机制和酶的调节

酶的活性部位（P384）

少数参与底物结合及催化作用的特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位或活性中心。

活性部位通常又被分为结合部位和催化部位，前者负责与底物的结合，决定酶的专一性；

后者负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力。

酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合的过程中，底物分子和酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这时催化基团的位置也正好在所催化底物键断裂和即将生成键的适当位置。

这个动态的辨认过程称为诱导契合。

酶的活性部位的特点（ppt）（催化活性特点6个）P384

1　酶的活性部位是一个三维实体。

2　活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，裂缝内是相当疏水的区域。

3　活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分。

4　底物通过多种弱的作用力结合到酶上。

（氢键、盐键、范德华力、疏水相互作用）

酶的活性部位与酶蛋白的空间构象的完整性之间，是辩证统一的关系。

Specificcatalyticgroupscontributetocatalysis（特定催化组有助于催化t93）

金属离子催化（P393）

1　通过静电稳定或屏蔽负电荷。

（通过电荷的屏蔽促进反应）

2　和质子的作用相似（和酸的催化作用相似），但有些金属离子不止带一个正电荷，作用比质子要强，并且可以在中性pH溶液中维持一定浓度。

3　通过水的离子化促进亲核催化。

4　通过结合底物为反应定向。

5　通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应。

酶活性的调节控制

1.别构调控（allostericregulation）

酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，称为酶的别构调节（allostericregulation）。

2.可逆的共价修饰调控（Covalentmodifications（reversible））

3.通过专一性的蛋白水解作用来活化酶和蛋白质（酶原的激活）（Proteolyticcleavage（irreversible））

4.（基因调控:

改变特定的酶的数量。

比活力

第六章、代谢

代谢总论和生物学能

新陈代谢是生命最基本的特征之一，泛指生物与周围环境进行物质交换、能量交换和信息交换的过程。

包括合成代谢（属同化作用）、分解代谢（属异化作用）

新陈代谢：

营养物质在生物体内所经历的一切化学变化总称为新陈代谢。

氧化作用所放出的能量与氧化途径无关，只要最后产物相同，释放出的总能量就相同。

最重要的两类调控反应：

反馈抑制、前馈激活

细胞中的主要代谢途径：

ATP是能量代谢的中心物质

辅酶的作用

参与电子的传递、基团的转移等，决定了酶所催化反应的性质。

维生素B3是NAD和NADPQ的组成成分

辅酶I：

NAD+/NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化/还原）

辅酶II：

NADP+/NADPH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化/还原）。

泛酸：

维生素B5是CoA的组成成分，CoA是生物体内转酰基酶的辅酶。

新陈代谢的功能概括为5个方面：

1）从周围环境中获得营养物质。

2）将外界引入的营养物质转变为自身需要的结构元件，即大分子的组成前体。

3）将结构元件装配成自身的大分子

4）合成或降解执行生物体特殊功能所需的生物分子。

5）提供生命活动所需的一切能量。

热学第一定律

能量守恒定律：

热力学第一定律是对能量守恒和转换定律的一种表述方式。

热力学第一定律指出，热能可以从一个物体传递给另一个物体，也可以与机械能或其他能量相互转换，在传递和转换过程中，能量的总值不变。

热学第二定律

热的传导只能由高温物体传至低温物体。

热的自发地逆向传导是不可能的。

这表明：

热力学体系的运动有一定的方向性，即自高温流向低温。

自由能（freeenergy）

物理意义：

－ΔＧ＝Ｗ*（体系中能对环境作功的能量）

自由能的变化能预示某一过程能否自发进行，即：

ΔG<

0，反应能自发进行

ΔG>

0，反应不能自发进行

ΔG=0，反应处于平衡状态。

标准条件：

反应的温度为25℃，大气压为101,325Pa（1atm），反应物和产物的浓度都是1mol/L。

偶联化学反应标准自由能变化的可加性及其意义

该规则表明一个在热力学上不利的反应，可以与热力学有利的反应偶联进行，即可以被热力学有利的反应所驱动而进行。

这在生物化学反应中是很多的。

高能磷酸化合物

机体内有许多含磷酸的化合物，当其磷酰基水解时，释放出大量的自由能，这类含磷酸的化合物称为高能磷酸化合物。

当这些磷酰基水解时，能释放出20.92kj/mol（5kcal/mol）以上的能量，因此将这些磷酸基团与其它基团之间的键称为“高能键”（high-energybond），并用符号～表示。

磷酸肌酸

当细胞处于静息状态时，ATP的浓度较高，反应向合成磷酸肌酸的方向进行。

当细胞处于活动状态时，ATP的浓度下降，反应即转向合成ATP的方向进行，因此磷酸肌酸有“ATP缓冲剂”之称。

本章小结

1.新陈代谢是生命最基本的特征之一，泛指生物与周围环境进行物质交换、能量交换和信息交换的过程，包括合成代谢和分解代谢。

2.新陈代谢的共同特点：

由酶催化，反应条件温和；

诸多反应有严格的顺序，彼此协调；

具有中间代谢。

3.辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ,FMN和FAD和辅酶A在能量代谢中的作用.

4.热力学第一定律：

能量守恒定律DU=Q-W

5.热力学第二定律：

6.标准自由能变化中涉及的计算问题。

7.偶联化学反应标准自由能变化的可加性及其意义：

在互相联系或称为偶联的化学反应中，这些相互联系的化学反应的总的自由能变化等于各步反应自由能变化的总和。

当其中一个反应的自由能变化为正值时，只要总反应的自由能变化为负值，这个反应也是能够进行的。

8.高能磷酸化合物的概念和种类。

9.ATP的特点和作用：

ATP中酸酐键不稳定容易水解，从而释放大量能量，是能量的中间传递体。

多糖和寡聚糖只有分解成小分子后才能被吸收利用，称为糖化。

淀粉的磷酸解

以磷酸代替水使淀粉分解形成1-磷酸葡萄糖的过程称淀粉的磷酸解，它是细胞内多糖的主要降解方式。

葡萄糖的主要代谢途径

糖酵解（Glycolysis）

糖酵解是将葡萄糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是生物体内普遍存在的葡萄糖降解的途径。

该途径也称作Embden-Meyethof途径，以纪念Embden和Mayerholf。

糖酵解是葡萄糖通过一系列的生化反应，逐步氧化成小分子化合物，并释放出能量合成ATP的过程。

糖酵解途径从葡萄糖开始，到生成2分子丙酮酸为止，在途径的前期消耗2分子ATP，后期合成4分子ATP，所以途径运行的结果，1分子葡萄糖可以产生2分子ATP。

把糖酵解途径加上丙酮酸转变成乙醇或乳酸称为无氧呼吸。

把糖酵解途径、柠檬酸循环加上呼吸电子传递链合称为有氧呼吸途径。

由葡萄糖经历丙酮酸最后生成乳酸，称为酵解过程。

由葡萄糖经历丙酮酸最后生成乙醇，称为发酵过程

糖酵解途径中磷酸化中间产物的意义

①带有负电荷的磷酸基团使中间产物具有极性，从而使这些产物不易透过脂膜而失散；

②磷酸基团在各反应步骤中，对酶来说，起到信号基团的作用，有利于与酶结合而被催化；

③磷酸基团经酵解作用后，最终形成ATP的末端磷酸基团，因此具有保存能量的作用。

激酶：

能够在ATP和任何一种底物之间起催化作用，转移磷酸基团的一类酶。

X-晶体衍射研究表明，在己糖激酶催化反应时有构象变化，其变化大致是，酶与葡萄糖结合时，结合裂缝两侧的酶叶关紧，糖被酶蛋白环绕造成非极性环境，从而促使ATP的磷酰基转移，防止水作为底物攻击ATP。

这种底物诱导的裂缝关闭现象是激酶的共同特性。

肝脏中存在一种专一性强的葡萄糖激酶，对于维持血糖的恒定起作用。

酵解第一阶段的反应

葡萄糖的磷酸化

酵解过程中的第一个调节酶：

己糖激酶（是别构酶）

（第一步反应在肝脏中）

己糖激酶以六碳糖为底物，其专一性不强，不仅可以作用于葡萄糖，还可以作用于D-果糖和D-甘露糖。

葡萄糖激酶：

存在于肝细胞中。

它对D-葡萄糖有特异活性。

葡萄糖—6—磷酸的异构化

这个同分异构化反应由（磷酸）葡萄糖异构酶催化。

葡萄糖C1上的羰基，不像C6上羟基那样容易磷酸化，将羰