实验三 果酒酵母的分离Word文件下载.docx
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148.34
147.32
145.94
6.56
菌种3
158.4
156.73
154.78
152.99
152.1
151.24
150.04
8.36
菌种4
155.1
153.97
152.04
150.34
149.42
148.66
147.7
7.4
菌种5
156.1
155.22
152.86
151.02
149.95
149.28
148.15
7.95
从上表可以看出1号菌株在发酵终了时CO2释放量（g）最多，即1号菌株发酵速度最快，是发酵速度较高的酵母。
不同发酵时间（d）CO2释放量/g
1
2
3
4
5
6
0.98
2.31
2.08
1.19
0.99
1.76
0.67
1.47
1.04
1.02
1.38
1.67
1.95
1.79
0.89
0.86
1.2
1.13
1.93
1.7
0.92
0.76
0.96
0.88
2.36
1.84
1.07
从上表可以看出1号和5号菌株在发酵开始时CO2释放量（g）最快，即1号和5号菌株发酵力最强。
3.耐受性试验
做1号菌株和5号菌株的耐受性试验：
采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（5%、6%、7%、8%、9%）二氧化硫（30、50、60、90、120mg/L）的耐性。
1号菌株
酒精量（%）
7
8
9
杜氏小管产气情况
充满小管
半管
小气泡
无气体
二氧化硫浓度（mg/L）
30
50
60
90
120
5号菌株
从上表可以看出1号和5号菌株对二氧化硫耐受力基本相同，5号菌株对酒精耐受力比1号菌株强。
果酒是利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。
果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质，经常适量饮用具有一定的保健作用。
酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。
果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响。
野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，酿造的果酒品质明显改善，因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。
本实验选用当季新鲜水果为原料，分离纯化3-5株酵母菌，并对其筛选使其适合果酒酿造。
一、实验目的和内容1.学习掌握果酒酵母分离纯化的方法；
2.对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。
二、实验原理
酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为7×
12μm，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。
优良纯种酵母应具备下列性能：
（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。
（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。
（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。
（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。
（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。
由此可见，酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。
要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。
果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。
根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。
为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖。
酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。
三、实验仪器与材料
样品：
苹果
YEPD培养基（富集培养基）:
蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml.
PDA培养基（酿酒酵母培养基）：
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至1000ml。
121℃灭菌30分钟。
）
器具：
三角烧瓶（250mL）、无菌试管、无菌吸管（1mL及5mL）、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。
四、实验方法与步骤
酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。
在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富，可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。
（1）．酵母菌的分离初筛
1）菌种采样
样品
土壤
叶片
果实（带柄）
腐果
瓜根际土壤
藤下方土壤
垄间隙土壤
采集
方法
用无菌小铲清去表层石块露出土壤后，戴好无菌手套取500g左右的土样装入无菌袋内。
用无菌剪刀剪取不同生长阶段的叶片装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取不同龄期的甜瓜（幼龄期，膨大期，成熟期）分别装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取腐烂的果实装入无菌袋内。
随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱内（冰块降温）。
2）富集培养与纯种分离
方法一：
配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品（土样1g，果皮5g，果柄若干，叶片若干）各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天。
将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。
待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。
待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。
菌种划线三到四次后基本纯化。
方法二：
将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养。
腐果表面长有白色菌落，镜检为酵母菌后，用接种环将其划线至PDA培养基上，28℃恒温培养。
待长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。
（2）．酵母菌种的复筛
选择果酒生产中生产性能优良的新鲜果汁液作为复筛培养基。
将初选菌种接入保藏培养基。
培养24h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25℃的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。
发酵力试验：
采用CO2失重法，取100mL三角瓶（已经烘干、称重），各加入80mL果汁，置于80℃的水浴杀菌5min，冷却到30℃后，按每升接种30mL的比例分别接入酵母种子液，在20℃下发酵。
发酵过程中每24h测定1次CO2损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。
随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻，直到减轻量不高于0.2g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。
（3）．酵母菌的耐受性试验
采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%）、二氧化硫（60、80、100、120、140、160、180、200mg/L）的耐性。
将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3次。
活化条件：
28℃条件下，将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h
发酵条件：
28℃条件下，水果原汁培养基中静止发酵4d；
接种量：
1×
107cfu/mL。
1）耐酒精度试验
采用先分别量取无水酒精8、10、12、14、16ml，再以水果原汁为培养基，制成含酒精量为10%、12%、14%、16%、18%系列的液体培养基。
按下表在试管中加入果汁。
然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃20min灭菌。
灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。
最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×
107个，28℃静止培养。
观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。
将标签贴于各试管上，标10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量：
试管编号
10
12
14
16
18
20
95%酒精/mL
1.05
1.26
1.4
1.68
1.90
2.15
果汁/mL
8.95
8.74
8.60
8.32
8.10
7.85
培养液含酒精%（v/v）
2）耐SO2试验
按亚硫酸含量为6%计，计算出60、100、120、180、240mg/L浓度所需的量，分别加入到果汁中制成SO2不同浓度系列的液体培养基。
按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃20min灭菌。
灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸（科密欧试剂SO2含量≥6%），加完后摇匀。
最后在每发酵管中接入对数期酵母1×
观察产气情况，选出耐SO2比较好的菌种。
将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：
亚硫酸/uL
17
40
培养液含SO2mg/L
100
180
240
五、技术指标
1．富集培养：
指从微生物混合群开始，对特定种的数量比例不断增高而引向纯培养的一种培养方法
富集培养基：
富集培养所采用的培养基为富集培养基
富集培养基的作用：
使混合微生物中的特定种的数量比例不断增高，并引向纯培养。
2.酵母菌镜检：
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍。
因此，不必染色即可用显微镜观察其形态。
3.血球计数板的使用
以计数酵母菌为例
（1）用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.
（2）样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.
（3）将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央计数室上加盖专用的厚玻片.
（4）将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.
（5）计数时,如果使用16格×
25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数.如果规格为25格×
16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格（即80个小方格）的酵母菌数.
（6）当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞（或只计数下方和左方线上的酵母细胞）.
（7）对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中
计算公式
（1）16格×
25格的血球计数板计算公式:
酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×
400×
104×
稀释倍数
（2）25格x16格的血球计数板计算公式:
酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×
六、实验时间进程表
1.3月11日10:
00-12:
00
配制YEPD培养基（富集培养基），配制PAD培养基（酿酒酵母培养基）
将买来的苹果削皮，把果皮放到研钵捣碎，等待接种用
2.3月11日16:
00-18:
将配制好的YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适果皮各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天
将PDA培养基灭菌，倒平板
将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养
3.3月14日16:
4.3月16日14:
00-17:
第一次纯化：
挑取单个菌落镜检为酵母菌后，用接种环将其划线至PDA培养基上，28℃恒温培养
将PDA培养基灭菌，倒平板待用
5.3月18日10:
第二次纯化
配制PDA培养基，PYG培养基（菌种保藏培养基）
6.3月18日16:
培养基、培养皿、试管灭菌
PDA培养基倒平板，PYG培养基倒斜面待用
7.3月19日10:
观察酵母菌生长状况，镜检看是否已纯化
第三次纯化
8.3月20日10:
00-10:
观察平板上是否长菌，未长出
9.3月21日14:
00-14:
观察平板上是否长菌，未长出，老师建议明天再来看，可能是培养基有问题
10.3月22日14:
00-15:
第四次纯化
镜检无杂菌的接种倒斜面上，保藏菌种2株
11.3月23日14:
00-16:
镜检无杂菌的接种倒斜面上，保藏菌种3株
开始进行复筛前准备
12.3月25日10:
制作酵母种子液：
将配制好的YEPD培养基分装于5个100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后将斜面上的5株菌分别接种到三角瓶中，120r/min，28℃摇床培养2天
13.3月27日14:
00-19:
稀释酵母种子液为2.67×
108个/ml
配制PAD培养基（发酵培养基），分装于5个100ml三角瓶内每瓶80ml高温灭菌冷却，然后，将酵母种子液（2ml）对应接种到发酵培养基，称重，28℃恒温培养。
酵母菌的耐受性试验：
采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（5%、6%、7%、8%、9%）二氧化硫（30、60、60、90、120mg/L）的耐性。
将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的PDA培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况
14.3月28日14:
称取发酵培养基的重量，记录数据
观察酵母菌的耐受性试验现象
15.3月29日14:
16．3月30日14:
17.3月31日14:
重复做一次酵母菌的耐受性试验
18.4月1日14:
19.4月2日14:
20.4月3日14:
21.4月4日14:
观察酵母菌的耐受性试验现象。
实验四果酒酵母发酵
1.果浆1.2L
2.果浆中总糖含量
F（g）
G（g/ml）
V（ml）
V1（ml）
V2（ml）
V3（ml）
X（g/L）
第一次
0.0625
0.0025
23
第二次
250
第三次
23.5
187.5
第四次
22.6
130
第五次
24.2
第六次
24.8
25
式中：
X——总糖或还原糖的含量，g／L；
F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各5mL相当于葡萄糖的克数，g；
V1——吸取的样品体积，mL；
V2——样品稀释后或水解定容的体积，mL；
V3——消耗试样的体积，mL；
G——葡萄糖标准溶液的准确浓度，g／mL；
V——消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。
所得结果应表示至一位小数。
第一次测得果浆中糖的含量为10g/L，1.2L果浆中含糖12g，向果浆中加糖316g，最后到25g/L
测定酒度
3.果浆中酸的含量
式中：
X——样品中滴定酸的含量，g/L；
c——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；
V1——样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
V0——空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
V2——吸取样品的体积，mL；
S苹果酸＝0.067
V0（ml）
0.57
0.10
1.57
0.50
0.09
2.75
0.65
0.05
4.02
1.64
0.12
5.09
0.63
3.89
0.81
4.76
第七次
0.61
4.20
第一次测得果浆中酸的含量为1.57g/L，向果浆中加入苹果酸4.43g
4.取100ml果汁加50ml蒸馏水，蒸馏得100ml液体，29oC下，测得酒精度7.5o，根据酒精度温度校正表得，20oC下，果汁的酒精度8o
选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。
一、实验目的和内容
1．掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。
2．用实验十三所筛选果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程，并对自酿果酒进行感官品评和理化分析检测（糖度、酸度、酒精度）。
二、实验原理果酒发酵：
果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。
可用以下反应式来说明：
果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。
在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。
用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。
按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
新鲜水果及压榨汁。
试剂：
亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土（有机物含量少的黄土）或者红土；
器皿：
三角烧瓶（250mL）、无菌试管、无菌吸管（1mL及5mL）、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.5×
1.2cm）冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。
1．自选酵母发酵性性能的检测试验：
用筛选菌种发酵果酒
（1）果酒酿造的工艺流程
鲜果→分选→破碎、除梗→果浆→分离取汁→澄清→清汁→发酵→倒桶→贮酒→过滤→冷处理→调配→过滤→成品
（2）工艺简述
1）发酵前的处理
前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。
①破碎、除梗：
破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。
破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。
②二氧化硫处理：
二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。
使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。
发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。
（以葡萄酒为例：
二氧化硫添加量的计算：
[葡萄果实×
70%×
60]/[0.06×
1000]。
）此外，尚需考虑下述因素：
原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；
原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；
温度高，易被结合且易挥发，用量略减；
微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；
霉变严重，用量增加。
2）果汁的调整：
取汁测定果汁中糖度和酸度，根据发酵需要调整糖度和酸度。
①糖的调整：
酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需17-20°
Bx。
如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。
②酸的调整：
酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；
使酒颜色鲜明；
使酒味清爽，并具有柔软感；
与醇生成酯，增加酒的芳香；
增加酒的贮藏性和稳定性。
干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。
3）酒精发酵
发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的4/5，然后加入3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在20-28℃，发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为3-12天。
残糖
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