DNA鉴定操作手册文档格式.docx

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在GSSTRPOP4（1ml）G5module运行开始的时候会自动进行这一加热步骤，仪器可能需要长达30分钟以达到60℃。

设置温度的步骤是：

关闭310的前门，打开ABIPRISM310Collectionsoftware，从Window菜单中选择ManualControl，再从下拉菜单中选择TemperatureSet，将温度设为60℃，点击Execute。

3设置分析参数运行ABIPRISM310Collectionsoftware，从Window菜单中选择Preferences，再选择GeneScanSampleSheetDefaults，将sizestandard颜色设为orange（O）。

从Page下拉菜单选择GeneScanInjectionListDefaults，five-dyemodule选择GSSTRPOP4（1ml）G5；

选择缺省的matrix文件；

选择AutoanalyzewithGeneScanAnalysis。

点击OK保存设置。

4建立5-dye样品表SampleSheet和上样表InjectionList

运行ABIPRISM310Collectionsoftware，从File菜单中选择New，显示CreateNew窗口，点击所要选择的48管或96管GeneScanSamleSheet图标，在所显示的样品表窗口右上角的下拉菜单中选择5Dye，在所显示的5色样品表中填好样品名、samleinformation和comments，指定适当的内标颜色，保存。

从File菜单中选择New，显示CreateNew窗口；

点击GeneScanInjectionList图标，显示上样表窗口；

在SampleSheet下拉菜单中选择正确的样品表，此时可以适当修改电泳参数，然后保存上样表。

在上样表窗口中，点击Run按钮，开始电泳。

2．作Matrix

1310/370系统使用的MatrixStandardSetDS-33（FilterSetG5）包括6-FAM（Blue）、VIC（Green）、NED（Yellow）、PET（Red）、LIZ（Orange）。

2310Matrix标准品制备：

每一Matrix标准品分别按如下比例制备一管：

Hi-Di甲酰胺10µ

l

310Matrix标准品1µ

切勿在Matrix标准品中加入GeneScan-500LIZ分子量标记。

混合物于95℃变性3min，迅速置于冰中冷却3min。

3填样品表：

在InjectionList中，Module选GSSTRPOP4（1ml）G5，MatrixFile选None。

4电泳完成后，在GeneScanAnalysis软件中，从File菜单选New，点击Matrix图标，选择5Dyes，指定B（6-FAM）、G（VIC）、Y（NED）、R（PET）、O（LIZ）各自对应的Matrix标准品电泳文件，Start输入3300（可以根据实际电泳结果调整到引物峰之后），Points输入2500，点击OK，计算机完成matrix制作并显示matrix文件表，将matrix文件保存到System文件夹的ABI文件夹中。

3．样品电泳

①电泳样品的准备

去甲离子酰胺

10µ

l×

（样品数+1）

GS-500

0.5～1µ

l×

PCR产物

1µ

总量

11.5～12µ

将去甲离子酰胺、GS-500各自振荡混匀、短暂离心，然后按所需用量吸入同一离心管中，振荡混匀、离心，每个离心管分装10.5～11µ

l，再向每管中加入PCR产物1µ

l，振荡混匀、短暂离心→95℃热变性5min，迅速放入冰水中冷却5min，然后上310进行电泳。

②从File菜单中选择New，显示CreateNew窗口，点击所要选择的48管或96管GeneScanSampleSheet图标，在所显示的样品表窗口右上角的下拉菜单中选择5-Dye，填好样品名；

填好sampleinfo如Blue，Green，Yellow，Red，对于AllelicLadder，则填好“Ladder”。

这对Genotyper分析数据非常重要，或者也可以将SampleName栏的内容拷贝到SampleInfo栏中。

填好InjectionList，保存后，点击Run按钮开始运行。

三、数据处理

（一）、用GeneScan软件进行数据分析

●设置分析参数

启动GeneScanAnalysis软件，单击File主菜单下New命令项，单击New窗口上的AnalysisParameters图标按钮，弹出AnalysisParameters窗口（图1），在此可以新建一个AnalysisParameters文件，新建AnalysisParameters文件有两种方法：

第一种通过File→New→AnalysisParameters；

第二种在Project窗口中通过DefineNew。

AnalysisParameters窗口共有7个部分：

①AnalysisRange-分析范围，有FullRange和ThisRange两种方式，选择ThisRange，输入开始及结束分析的数据点，与尺寸必要范围保持一致，数据分析范围包含尺寸必要范围。

②SizeCallRange-尺寸必要范围，有FullRange和ThisRange两种方式，选择ThisRange，输入最小-75bp及最大-450bp必要尺寸。

③DataProcessing-数据处理，有无-None、轻-Light、重-Heavy三种方式，选择Light；

图1

④SizeCallingMethod-尺寸命令方法，一定要选择LocalSouthernMethod。

⑤PeakDetection-峰检测，PeakAmplitudeThresholds-峰振幅极限，输入具体的极限后，低于这些极限的峰经分析后不显示尺寸大小等数据分析结果；

Min.PeakHalfWidth-最小峰半径，默认值为2Pts；

PolynomialDegree-多项式次数，默认值为3；

PeakWindowSize-峰窗口大小，默认值为19Pts，但在分析AllelicLadder时，要将此值适当改小，否则绿色荧光染料标记的TH01基因型会少一种，造成Genotyper无法分析；

⑥Baselining-基线，BaselineWindowSize-基线窗口大小，默认值为251Pts；

⑦AutoAnalysisOnlySizeStandard-自动分析的标准尺寸，默认为None。

●设置尺寸标准

New窗口上的SizeStandard图标按钮，功能在于建立新的尺寸标准。

单击

SizeStandard图标按钮，弹出SelectSampleFile窗口（图2），在此窗口选择一个样品文件作为建立新尺寸标准的模板，然后按Open，弹出SelectDyeandAnalysisParameters窗口（图3），在此窗口选择用于产生新尺寸标准的染料标记颜色及分析参数，然后按Ok，弹出一个未命名的窗口（图4），在这个窗口

图2

图3

图4

图5

显示一组峰柱形图，根据峰的位置命名峰所对应的尺寸大小75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450bp，其中250bp对应的峰不标记（图5），单击窗口右上角的关闭按钮弹出Savethisdocumentas窗口，在此保存新的尺寸标准（图6）。

建立SizeStandard文件有两种方法：

第一种通过File→New→SizeStandard；

第二种在Project窗口中的样品文件的SizeStandard拉出选项中的DefineNew栏。

图6

●分析样品

1运行GeneScanAnalysisSoftwarev3.7；

2单击File主菜单下New命令项，在弹出的New窗口中单击Project图标按钮，弹出一个未命名的AnalysisControl窗口（图7），

（图7）

3在Project主菜单下单击AddSampleFile…选项，弹出AddSampleFile…窗口（图8），在Lookin栏中选择要分析的样品运行文件，在此时的AddSampleFile…窗口（图9）中加入具体的样品文件，然后单击Finish按钮，这时AnalysisControl窗口如图10所示，其中SizeStandard、Parameters栏处于

图8图9

图10

图11

CollectionSetting状态，双击样品文件（图中黑色阴影）弹出样品未分析的数据图窗口（图11），在窗口左下角有一排图标

，其中

为未分析或分析后的数据图（图11或图16）；

为样品文件的信息（图12），可以对样品的原始信息进行修改；

为尺寸标准曲线图（图13，说明：

若样品没有分析此时没有尺寸标准图，只有在样品分析后才有此图）；

为样品的原始电泳数据图（图14）；

为样品的电泳时静电记录数据图（图15）；

图12图13

图14图15

4回到图10所示的AnalysisControl窗口，首先检查内标标记

是否存在，若无按住“Ctrl”键，再单击内标，然后向每个样品加载Matrix文件以除去干扰，在SizeStandard栏中选择已定义的尺寸标准，在Parameters栏中选择分析参数，单击窗口上的Analyze按钮进行分析，分析完后，双击样品文件，弹出分析好的数据图（图16）。

数据图分为两部分，上半部为STR位点峰形图，下半部为所对应的位点尺寸大小、峰高、峰面积、出现此峰的时间、数据扫描点。

图16为所有检测的STR位点的数据图，可以单击中间一排的

颜色指示按钮，来查看各颜色标记的位点数据图，图17为

染料标记的STR位点数据图，适当调整

基线值除去杂峰；

（可以使用左上角的放大镜来放大数据图，如图18）

图16

图17

图18

图19

图19为

染料标记的STR位点数据图，调整

图20

图20为

染料标记的STR位点数据图,调整

图21

图21为

图22

图22为

染料标记的标准尺寸数据图，共12个标准尺寸点，其中250bp没有指定；

同上面一样再逐次对其它样品进行精分析，分析好的数据就可以通过Genotyper软件进行基因分型。

（二）、使用Genotyper软件进行自动基因分型

①双击桌面上的Genotyper图标，运行GenotyperSoftwarev3.7；

②将参数缺省值设置成输入rawdata，Blue，Green，Yellow，Red和Orange；

③从File菜单选择ImportGeneScanFile（s），选择文件并点击Import；

④从主页面左下角的宏命令列表中选择CheckGS500，从Marco菜单选择RunMarco；

⑤从主页面左下角的宏命令列表中选择Kazam，从Marco菜单选择RunMarco；

⑥查看数据、校正。