DNA鉴定操作手册文档格式.docx

1、在GS STR POP4（1ml）G5 module运行开始的时候会自动进行这一加热步骤，仪器可能需要长达30分钟以达到60。设置温度的步骤是：关闭310的前门，打开ABI PRISM310 Collection software，从Window菜单中选择Manual Control，再从下拉菜单中选择Temperature Set，将温度设为60，点击Execute。3 设置分析参数 运行ABI PRISM310 Collection software，从Window菜单中选择Preferences，再选择GeneScan Sample Sheet Defaults，将size standa

2、rd颜色设为orange（O）。从Page下拉菜单选择GeneScan Injection List Defaults，five-dye module选择GS STR POP4（1ml）G5；选择缺省的matrix文件；选择Autoanalyze with GeneScan Analysis。点击OK保存设置。4 建立5-dye样品表Sample Sheet和上样表Injection List 运行ABI PRISM310 Collection software，从File菜单中选择New，显示Create New窗口，点击所要选择的48管或96管GeneScan Samle Sheet图标，

3、在所显示的样品表窗口右上角的下拉菜单中选择5 Dye，在所显示的5色样品表中填好样品名、samle information和comments，指定适当的内标颜色，保存。 从File菜单中选择New，显示Create New窗口；点击GeneScan Injection List图标，显示上样表窗口；在Sample Sheet下拉菜单中选择正确的样品表，此时可以适当修改电泳参数，然后保存上样表。在上样表窗口中，点击Run按钮，开始电泳。2作Matrix 1 310/370系统使用的Matrix Standard Set DS-33（Filter Set G5）包括6-FAM（Blue）、VIC（

4、Green）、NED（Yellow）、PET（Red）、LIZ（Orange）。2 310 Matrix标准品制备：每一Matrix标准品分别按如下比例制备一管：Hi-Di甲酰胺 10l310Matrix标准品 1切勿在Matrix标准品中加入GeneScan-500 LIZ分子量标记。混合物于95变性3min，迅速置于冰中冷却3min。3 填样品表：在Injection List中， Module选GS STR POP4（1ml）G5，Matrix File选None。4 电泳完成后，在GeneScan Analysis软件中，从File菜单选New，点击Matrix图标，选择5Dyes，指

5、定B（6-FAM）、G（VIC）、Y（NED）、R（PET）、O（LIZ）各自对应的Matrix标准品电泳文件，Start输入3300（可以根据实际电泳结果调整到引物峰之后），Points输入2500，点击OK，计算机完成matrix制作并显示matrix文件表，将matrix文件保存到System文件夹的ABI文件夹中。3样品电泳电泳样品的准备去甲离子酰胺10l （样品数+1）GS-5000.51lPCR产物1总量11.512将去甲离子酰胺、GS-500各自振荡混匀、短暂离心，然后按所需用量吸入同一离心管中，振荡混匀、离心，每个离心管分装10.511l，再向每管中加入PCR产物1l，振荡混匀

6、、短暂离心95热变性5min，迅速放入冰水中冷却5min，然后上310进行电泳。从File菜单中选择New，显示Create New窗口，点击所要选择的48管或96管GeneScan Sample Sheet图标，在所显示的样品表窗口右上角的下拉菜单中选择5-Dye，填好样品名；填好sample info如 Blue，Green，Yellow，Red，对于Allelic Ladder，则填好“Ladder”。这对Genotyper分析数据非常重要，或者也可以将Sample Name栏的内容拷贝到Sample Info栏中。填好Injection List，保存后，点击Run按钮开始运行。三、

7、数据处理（一）、用GeneScan软件进行数据分析 设置分析参数启动GeneScan Analysis软件，单击File主菜单下New命令项，单击New窗口上的Analysis Parameters图标按钮，弹出Analysis Parameters窗口（图1），在此可以新建一个Analysis Parameters文件，新建Analysis Parameters文件有两种方法：第一种通过FileNewAnalysis Parameters；第二种在Project窗口中通过Define New。Analysis Parameters窗口共有7个部分：Analysis Range-分析范围，有F

8、ull Range和This Range两种方式，选择This Range，输入开始及结束分析的数据点，与尺寸必要范围保持一致，数据分析范围包含尺寸必要范围。Size Call Range-尺寸必要范围，有Full Range和This Range两种方式，选择ThisRange，输入最小-75bp及最大-450bp必要尺寸。Data Processing-数据处理，有无-None、轻-Light、重-Heavy三种方式，选择Light； 图1Size Calling Method-尺寸命令方法，一定要选择Local Southern Method。Peak Detection-峰检测，Pea

9、k Amplitude Thresholds-峰振幅极限，输入具体的极限后，低于这些极限的峰经分析后不显示尺寸大小等数据分析结果；Min.Peak Half Width-最小峰半径，默认值为2Pts；Polynomial Degree-多项式次数，默认值为3；Peak Window Size-峰窗口大小，默认值为19Pts，但在分析Allelic Ladder时，要将此值适当改小，否则绿色荧光染料标记的TH01基因型会少一种，造成Genotyper无法分析；Baselining-基线，Baseline Window Size-基线窗口大小，默认值为251Pts；Auto Analysis On

10、ly Size Standard-自动分析的标准尺寸，默认为None。 设置尺寸标准New窗口上的Size Standard图标按钮，功能在于建立新的尺寸标准。单击Size Standard图标按钮，弹出Select Sample File窗口（图2），在此窗口选择一个样品文件作为建立新尺寸标准的模板，然后按Open，弹出Select Dye and Analysis Parameters窗口（图3），在此窗口选择用于产生新尺寸标准的染料标记颜色及分析参数，然后按Ok，弹出一个未命名的窗口（图4），在这个窗口 图2 图3 图4 图5显示一组峰柱形图，根据峰的位置命名峰所对应的尺寸大小75、10

11、0、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450bp，其中250bp对应的峰不标记（图5），单击窗口右上角的关闭按钮弹出Save this document as窗口，在此保存新的尺寸标准（图6）。建立Size Standard文件有两种方法：第一种通过FileNewSize Standard；第二种在Project窗口中的样品文件的Size Standard拉出选项中的Define New栏。 图6 分析样品1 运行GeneScan Analysis Software v3.7；2 单击File主菜单下New命令项，在弹出的New窗口中单击Project图标

12、按钮，弹出一个未命名的Analysis Control窗口（图7）， （图7）3 在Project主菜单下单击Add Sample File选项，弹出Add Sample File窗口（图8），在Look in栏中选择要分析的样品运行文件，在此时的Add Sample File窗口（图9）中加入具体的样品文件，然后单击Finish按钮，这时Analysis Control窗口如图10所示，其中Size Standard、Parameters栏处于 图8 图9 图10 图11Collection Setting状态，双击样品文件（图中黑色阴影）弹出样品未分析的数据图窗口（图11），在窗口左下角有

13、一排图标，其中为未分析或分析后的数据图（图11或图16）；为样品文件的信息（图12），可以对样品的原始信息进行修改；为尺寸标准曲线图（图13，说明：若样品没有分析此时没有尺寸标准图，只有在样品分析后才有此图）；为样品的原始电泳数据图（图14）；为样品的电泳时静电记录数据图（图15）；图12 图13图14 图154 回到图10所示的Analysis Control窗口，首先检查内标标记是否存在，若无按住“Ctrl”键，再单击内标，然后向每个样品加载Matrix文件以除去干扰，在Size Standard栏中选择已定义的尺寸标准，在Parameters栏中选择分析参数，单击窗口上的Analyze按

14、钮进行分析，分析完后，双击样品文件，弹出分析好的数据图（图16）。数据图分为两部分，上半部为STR位点峰形图，下半部为所对应的位点尺寸大小、峰高、峰面积、出现此峰的时间、数据扫描点。图16为所有检测的STR位点的数据图，可以单击中间一排的颜色指示按钮，来查看各颜色标记的位点数据图，图17为染料标记的STR位点数据图，适当调整基线值除去杂峰；（可以使用左上角的放大镜来放大数据图，如图18） 图16 图17 图18 图19图19为染料标记的STR位点数据图，调整 图20图20为染料标记的STR位点数据图, 调整 图21图21为 图22图22为染料标记的标准尺寸数据图，共12个标准尺寸点，其中250

15、bp没有指定；同上面一样再逐次对其它样品进行精分析，分析好的数据就可以通过Genotyper软件进行基因分型。（二）、使用Genotyper软件进行自动基因分型双击桌面上的Genotyper图标，运行Genotyper Software v3.7；将参数缺省值设置成输入raw data，Blue，Green，Yellow，Red 和Orange；从File菜单选择Import GeneScan File（s），选择文件并点击Import；从主页面左下角的宏命令列表中选择 Check GS500，从Marco菜单选择Run Marco；从主页面左下角的宏命令列表中选择Kazam，从Marco菜单选择Run Marco；查看数据、校正。