谈产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究Word文档格式.docx
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1．材料与方法
1.1土壤的来源
土壤取自农药厂的排污水沟和附近的农田。
1.2
乙酰胆碱酯酶从家蝇头部提取。
1.3培养基
富集培养基（%）：
NaNO32，KCl0.5,CaCl20.05，KH2PO41，MgSO4.7H2O0.5，pH7.0,使用前加入适量敌敌畏浓缩液。
分离培养基（%）：
KH2PO40.5，（NH4）SO40.5，FeSO4
O.001g，K2HPO40.2，CaC120.005,MgSO4.7H2O
0.2，使用前加入适量敌敌畏浓缩液。
发酵培养基（%）：
蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl1.0，pH7.0。
1.4 菌株的富集、驯化和筛选
取2g土样于100m1富集培养基中，加敌敌畏至100mg/L，37℃振荡培养24h，所得菌液接入新的富集培养基中（接种量10%），并提高敌敌畏浓度到200mg/L，24h后接入新的富集培养基中，敌敌畏终浓度提高至300mg/L，如此循环至培养液中敌敌畏浓度达到500mg/L。
然后，将培养液接入分离培养基（敌敌畏浓度为500mg/L）继续培养，一周后再移种一次。
将富集所得菌液适当稀释，涂布于分离平板，观察是否有菌落生长，选择生长旺盛的菌落进行纯化。
1.5敌敌畏降解酶粗酶液的提取
用发酵培养基培养菌体，离心收集菌体，用0.02mol/L,pH7.0的磷酸缓冲液洗涤后再离心，用适量磷酸缓冲液悬浮所得菌体，用JY92-II型超声波细胞粉碎机破碎细胞（工作电压220V，工作时间10S，间隔时间15S，120个循环），离心所得上清液即粗酶液。
1.6乙酰胆碱酯酶活性测定
乙酰胆碱酯酶能分解靛酚乙酸酯（红色）为靛酚（蓝色）和乙酸，靛酚的吸收峰在605nm，所以可以通过吸光度变化值来测定酶活力。
在试管中加入10μl乙酰胆碱酯酶，470μl0.02mol/L，pH7.0磷酸缓冲液，20μl
2%靛酚乙酸酯，混匀，37℃水浴中反应5分钟，加入500μl
95％乙醇终止反应，测OD605，计算酶活力。
1.7乙酰胆碱酯酶抑制法检测农药残留
在试管中加入470μl不同浓度的有机磷农药（对照管加dH2O）,10μl乙酰胆碱酯酶，混匀，于37℃水浴中反应10分钟，加入20μl靛酚乙酸酯，混匀，37℃反应5分钟，加入500μl95％乙醇终止反应，测OD605。
计算酶的抑制率，以农药浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标作出标准曲线。
抑制率的计算公式为:
I=（Uo一UI）/Uo×
100%
其中Uo：
未受抑制的酶活力，
UI：
受农药抑制的酶活力。
1.8有机磷农药降解酶酶活力的测定
取470μl粗酶液，加敌敌畏至1000mg/L，37℃反应30分钟，沸水中加热5分钟终止反应，然后用酶抑制法测定农药残留。
酶活力单位定义：
在37℃，pH7.0的条件下，每分钟分解0.1µ
g敌敌畏所需的酶量为一个酶活单位（U）。
2.结果与分析
2.1 菌株的筛选
通过驯化和筛选,分离出7株能降解敌敌畏的菌株。
2．2有机磷农药降解酶在细胞上的定位
菌液离心后取上清，将菌体重悬浮于0.05mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液中，得菌体液，取其中的一部分进行超声波破壁，离心所得上清即为破壁菌液，分别测定上清、菌体液和破壁菌液的敌敌畏降解酶的酶活性，结果表明，只有破壁菌液有酶活性，这说明该酶是胞内酶。
2.3 各菌株有机磷农药降解酶活力的测定
破壁收集各菌株的粗酶液，测定酶活力，结果表明，菌株OPD7的酶活力最高（表1），所以选它来进行酶学特性的研究。
表1
各菌株有机磷农药降解酶的酶活力比较
菌株
OPD1
OPD2
OPD3
OPD4
OPD5
OPD6
OPD7
酶活（U/ml）126
88
132
165
103
150
196
2.4
OPD7菌株的敌敌畏降解酶的酶学性质的研究
2.4.1温度对酶活力的影响
在不同的酶促反应温度下测定酶活力，结果表明，最适反应温度为42℃，温度在低于42℃时，酶活性随温度的升高而上升（图1）。
图1
温度对敌敌畏降解酶活力的影响
2.4.2酶的热稳定性
在不同的温度下处理酶液20分钟，测剩余酶活力，结果表明，在低于47℃时酶的稳定，但超过47℃后酶活力便急剧下降（图2）。
图2
敌敌畏降解酶的热稳定性
2.4.3pH对酶活力的影响
在不同的酶促反应pH下测定酶活力，结果表明，其最适反应pH为7.0，在pH6-8的范围内相对酶活力均在90%以上（图3）。
图3
pH值对敌敌畏降解酶酶活力影响
2.4.5
酶的pH稳定性
图4所示为酶的pH稳定性曲线，从图中可以看出，在不同的pH下保温20分钟后酶的相对活力变化很大，在碱性条件下酶活降低很多。
图4
敌敌畏降解酶的pH稳定性
2.4.6酶的专一性的研究。
有机磷农药降解酶能够破坏有机磷的磷脂键而使其脱毒，由于各种有机磷农药的结构相似，只是取代基不同，所以通常一种有机磷降解酶可降解多种有机磷农药，所以我们进行了4种有代表性的有机磷农药酶促降解实验，结果表明，OPD7菌株所产的敌敌畏降解酶都能降解乙酰甲胺磷，甲胺磷，乐果，氧化乐果（表3），说明该菌株对有机磷农药的降解具有广谱性，值得进一步研究。
表3
敌敌畏降解酶对不同农药的降解
农药
乙酰甲胺磷 甲胺磷 乐果 氧化乐果
起始浓度（mg/L）
400
250
500
200
反应时间（分钟） 10
10
10
终止浓度（mg/L） 50
105
80
40
降解率
87.5％
58％
84％
80％
3.讨论
目前国内已广泛采用胆碱酶抑制法来检测农产品的农药残留[4,5,6]，该方法的最大特点是简单、快速，灵敏度也比较高，由于<
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