谈产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究Word文档格式.docx

1、1材料与方法1.1 土壤的来源土壤取自农药厂的排污水沟和附近的农田。1.2 乙酰胆碱酯酶从家蝇头部提取。1.3 培养基富集培养基（%）：NaNO3 2，KCl 0.5,CaCl2 0.05 ，KH2PO4 1，MgSO4.7H2O 0.5，pH7.0,使用前加入适量敌敌畏浓缩液。分离培养基（%）：KH2PO4 0.5，（NH4）SO4 0.5，FeSO4 O.001g，K2HPO40.2， CaC120.005 ,MgSO4.7H2O 0.2，使用前加入适量敌敌畏浓缩液。发酵培养基（%）：蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl 1.0， pH7.0。1.4菌株的富集、驯化和筛选取2 g土样于10

2、0m1富集培养基中，加敌敌畏至100 mg/L， 37振荡培养24 h，所得菌液接入新的富集培养基中（接种量10%），并提高敌敌畏浓度到200 mg/L，24h后接入新的富集培养基中，敌敌畏终浓度提高至300 m g/L，如此循环至培养液中敌敌畏浓度达到500m g/L。然后，将培养液接入分离培养基（敌敌畏浓度为500mg/L）继续培养，一周后再移种一次。将富集所得菌液适当稀释，涂布于分离平板，观察是否有菌落生长，选择生长旺盛的菌落进行纯化。1.5 敌敌畏降解酶粗酶液的提取用发酵培养基培养菌体，离心收集菌体，用0.02mol/L, pH7.0的磷酸缓冲液洗涤后再离心，用适量磷酸缓冲液悬浮所得菌

3、体，用JY92-II型超声波细胞粉碎机破碎细胞（工作电压220V，工作时间10S，间隔时间15S，120个循环），离心所得上清液即粗酶液。1.6乙酰胆碱酯酶活性测定乙酰胆碱酯酶能分解靛酚乙酸酯（红色）为靛酚（蓝色）和乙酸，靛酚的吸收峰在605nm，所以可以通过吸光度变化值来测定酶活力。在试管中加入10l 乙酰胆碱酯酶，470l 0.02mol/L，pH7.0磷酸缓冲液，20l 2%靛酚乙酸酯，混匀，37水浴中反应5分钟，加入500l 95乙醇终止反应，测OD605，计算酶活力。1.7乙酰胆碱酯酶抑制法检测农药残留在试管中加入470l不同浓度的有机磷农药（对照管加dH2O）, 10l 乙酰胆碱酯

4、酶，混匀，于37水浴中反应10分钟，加入20l靛酚乙酸酯，混匀，37反应5分钟，加入500l 95乙醇终止反应，测OD605。计算酶的抑制率，以农药浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标作出标准曲线。抑制率的计算公式为:I= （Uo一UI） /Uo 100%其中 Uo：未受抑制的酶活力，UI：受农药抑制的酶活力。1.8有机磷农药降解酶酶活力的测定取470l粗酶液，加敌敌畏至1000 mg/L，37反应30分钟，沸水中加热5分钟终止反应，然后用酶抑制法测定农药残留。酶活力单位定义： 在37，pH7.0的条件下，每分钟分解0.1g敌敌畏所需的酶量为一个酶活单位（U）。2.结果与分析2. 1菌株的筛选通

5、过驯化和筛选,分离出7株能降解敌敌畏的菌株。22 有机磷农药降解酶在细胞上的定位 菌液离心后取上清，将菌体重悬浮于0.05 mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液中，得菌体液，取其中的一部分进行超声波破壁，离心所得上清即为破壁菌液，分别测定上清、菌体液和破壁菌液的敌敌畏降解酶的酶活性，结果表明，只有破壁菌液有酶活性，这说明该酶是胞内酶。2. 3各菌株有机磷农药降解酶活力的测定 破壁收集各菌株的粗酶液，测定酶活力，结果表明，菌株OPD7的酶活力最高（表1），所以选它来进行酶学特性的研究。表1 各菌株有机磷农药降解酶的酶活力比较菌株 OPD1 OPD2 OPD3OPD4OPD5OPD6 OPD7酶活（

6、U/ml） 126 88 132 165 103 150 1962. 4 OPD7菌株的敌敌畏降解酶的酶学性质的研究2.4.1 温度对酶活力的影响在不同的酶促反应温度下测定酶活力，结果表明，最适反应温度为42，温度在低于42时，酶活性随温度的升高而上升（图1）。图1 温度对敌敌畏降解酶活力的影响2.4.2 酶的热稳定性在不同的温度下处理酶液20分钟，测剩余酶活力，结果表明，在低于47时酶的稳定，但超过47后酶活力便急剧下降（图2）。 图2 敌敌畏降解酶的热稳定性2.4.3 pH对酶活力的影响在不同的酶促反应pH下测定酶活力，结果表明，其最适反应pH为7.0，在pH 6-8的范围内相对酶活力均在

7、90%以上（图3）。 图3 pH值对敌敌畏降解酶酶活力影响2. 4.5 酶的pH稳定性 图4所示为酶的pH稳定性曲线，从图中可以看出，在不同的pH下保温20分钟后酶的相对活力变化很大，在碱性条件下酶活降低很多。图4 敌敌畏降解酶的pH稳定性2.4.6 酶的专一性的研究。有机磷农药降解酶能够破坏有机磷的磷脂键而使其脱毒，由于各种有机磷农药的结构相似，只是取代基不同，所以通常一种有机磷降解酶可降解多种有机磷农药，所以我们进行了4种有代表性的有机磷农药酶促降解实验，结果表明，OPD7菌株所产的敌敌畏降解酶都能降解乙酰甲胺磷，甲胺磷，乐果，氧化乐果（表3），说明该菌株对有机磷农药的降解具有广谱性，值得

8、进一步研究。 表 3 敌敌畏降解酶对不同农药的降解农药 乙酰甲胺磷甲胺磷乐果氧化乐果起始浓度（mg/L） 400250 500 200反应时间（分钟） 101010 终止浓度（mg/L） 501058040降解率87.558 84 803.讨论目前国内已广泛采用胆碱酶抑制法来检测农产品的农药残留4,5,6，该方法的最大特点是简单、快速，灵敏度也比较高，由于SPAN style=FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 宋体; mso-ascii-font-family: Times New Roman; mso-hansi-font-family: mso-font-kerning: 0