厌氧氨氧化菌的特性与分类图文精Word文档下载推荐.docx
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形态;
生理;
生化;
种类中图分类号:
Q９３９.９;
X５３ 文献标志码:
A
ZHENGPing,ZHANGLei（DepartmentofEnvironmentalEngineering,CollegeofEnvironmentalandResourceSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China）
Characterizationandclassificationofanaerobicammoniumoxidation（anammoxbacteria.JournalofZhejiangUniversity（Agric畅&
LifeSci畅,２００９,３５（５:
４７３‐４８１Abstract:
Anaerobicammonium
oxidation（anammoxisoneofimportantdiscoveriesinboth
environmentalandmicrobiologicalfields.Itsupplementsbiogeochemistryofnitrogencycleinnature,extendsmicrobialdiversityandurgesdevelopmentofnovelnitrogenremovalbiotechnology.Recently,pl
entybreakthroughshavebeenmadeintheresearchofanammoxbacteria.Theirpropertiesinbacterialmorphology,cytochemistry,enrichmentandisolation,physiologyandbiochemistry,ecologywererevealed,andprobablemetabolicmodelswereproposed,andtheimportantenzymeswerepurifiedandcharacterized.AfamilyofAnammoxaceaeincludingfivegenus,ninespecieshasbeenestablished.Thispaperi
sasystematicreviewinthefeaturesofanammoxbacteriaandthenineidentifiedspecies.Keywords:
anammoxbacteria;
morphology;
physiology;
biochemistry;
species
在厌氧条件下,以亚硝酸盐作为氧化剂将氨
氧化成氮气的生物反应称为厌氧氨氧化[１
].１９９５
年,由荷兰Mulder等[２
]首先在一个处理酵母废水的反硝化中试装置内发现该反应过程.此后,人们陆续在海洋、河流、湖泊底泥等自然环境中检测出厌氧氨氧化反应,并认为它在氮素生物地
球化学循环中起着举足轻重的作用.据估计,其
氮气产量占海洋氮气释放量的３０％～５０％[３‐４
].在环境工程上,厌氧氨氧化反应已成功地应用于废水生物脱氮处理.据报道,在荷兰鹿特丹污水
处理厂,利用厌氧氨氧化工艺对污泥压滤液进行脱氮处理,反应器总氮去除率高达９.５kg爛m－３
爛
d
－１[５]
显示了诱人的应用前景.厌氧氨氧化的推
动者———厌氧氨氧化菌是一群分支很深的浮霉状菌,其特殊的细胞结构、代谢方式和进化地位引起了生物学家的高度关注.本文拟就厌氧氨氧化菌的研究进展作一综述.
１ 厌氧氨氧化菌的特性
1畅1 个体形态特征
cw:
细胞壁;
cm:
细胞膜;
pa:
外室细胞质;
icm:
胞质内膜;
ri:
核糖细胞质;
am:
厌氧氨氧化体膜;
a:
厌氧氨氧化体.长箭头:
管状结构;
短箭头:
电子密集颗粒.
图1 厌氧氨氧化菌细胞的超微结构图
Fig.１ Ultrastructureofanammoxbacterialcell
厌氧氨氧化菌形态多样,呈球形、卵形等,直径０畅８～１畅１μm[６
].厌氧氨氧化菌是革兰氏阴性菌.细胞外无荚膜.细胞壁表面有火山口状结构[
７]
少数有菌毛[
６]
.细胞内分隔成３部分:
厌氧氨氧化体（anammoxosome、核糖细胞质（ri
boplasm及外室细胞质（paryphoplasm.核糖细胞质中含有核糖体和拟核,大部分DNA存在于此[
８]
.该菌出芽生殖.
厌氧氨氧化体是厌氧氨氧化菌所特有的结构,占细胞体积的５０％～８０％,厌氧氨氧化反应在其内进行[
.厌氧氨氧化体由双层膜包围,
该膜深深陷入厌氧氨氧化体内部[９
]（图１.厌氧氨氧化体不含核糖体,但含六角形的管状结构和电子密集颗粒.透射电镜及能谱仪分析表
明,这些电子密集颗粒中含有铁元素[９
].
1畅2 细胞壁和细胞膜化学组分特征
厌氧氨氧化菌的细胞壁主要由蛋白质组成,不含肽聚糖.细胞膜中含有特殊的阶梯烷膜脂,
由多个环丁烷组合而成,形状类似阶梯[１０
].在各种厌氧氨氧化菌中,阶梯烷膜脂的含量基本相似.疏水的阶梯烷膜脂与亲水的胆碱磷酸、乙醇胺磷酸或甘油磷酸结合形成磷脂,构成细胞膜的骨架.细胞膜中的非阶梯烷膜脂由直链脂肪酸、支链脂肪酸、单饱和脂肪酸和三萜系化合物组成.三萜系化合物包括C２７的藿烷类化合物
（hopanoi
d,细菌藿四醇（bacteriohopanetetrol,BHT和鲨烯（squalene,C３０H５０.其中,BHT首次发现于严格厌氧菌中[１１
].在不同厌氧氨氧化菌种中,非阶梯烷膜脂的种类和含量变化较大[１２
].曾一度认为阶梯烷膜脂只存在于厌氧氨氧化体的双层膜上,其功能是限制有毒中间产物的扩散.目前认为阶梯烷膜脂存在于厌氧氨氧化菌的所有膜结构上（包括细胞质膜,它们与非阶梯烷膜脂相结合,以确保其他膜结构的穿透性好
于厌氧氨氧化体膜[１０,１２]
.1畅3 富集培养与分离特征
厌氧氨氧化菌的富集培养选用自然样品作为接种物（如活性污泥、海洋底泥、土壤,按目标菌群所需的最佳生境条件,以含有适量基质和营养元素的培养液（表１在生物反应器中进行[７
].厌氧氨氧化菌生长缓慢,倍增时间１０～
３０d[８
].富集培养物呈红色,性状粘稠,含有较
多的胞外多聚物[１３]
.
厌氧氨氧化菌是一种难培养的微生物,采用系列稀释分离、平板划线分离、显微单细胞分离等传统微生物分离方法,均未分离成功.迄今为止,密度梯度离心法是成功分离厌氧氨氧化菌的唯一方法.其原理是通过离心使不同密度
的细菌细胞形成不同的沉降带[１４
].具体操作方法如下:
首先,用超声波温和破碎厌氧氨氧化菌富集培养物,将菌群分散成单个细胞;
接着,离心去除残留的聚集体（生物膜或絮体碎片;
最后,将分散的细胞用Percoll密度梯度离心,使厌氧氨氧化菌在离心管内形成一条深红色条带.采用该方法可获得高纯度的细胞悬液,每
２００～８００个细胞中可只含有１个污染细胞[１５
表1 富集厌氧氨氧化菌的营养元素组成Table１ Nutrientsusedforanammoxbacteriaenrichment
营养物质量浓度/（g爛L－１KH２PO４０畅０２７
CaCl２０畅１８
MgSO４爛７H２O０畅３
KHCO３０畅５
微量元素溶液ⅠEDTA５
FeSO４５
微量元素溶液ⅡEDTA１５
H３BO４０畅０１４
MnCl２爛４H２O０畅９９
CuSO４爛５H２O０畅２５
ZnSO４爛７H２O０畅４３
NiCl２爛６H２O０畅１９
NaMoO４爛２H２O０畅２２
NaSeO４爛１０H２O０畅２１
1畅4 生理生化特征
厌氧氨氧化菌为化能自养型细菌[７],以二氧化碳作为唯一碳源,通过将亚硝酸氧化成硝酸来获得能量,并通过乙酰‐CoA途径同化二氧化碳[１６].虽然有的厌氧氨氧化菌能够转化丙酸、乙酸等有机物质,但它们不能将其用作碳源[１７‐１８].厌氧氨氧化菌对氧敏感,只能在氧分压低于５％氧饱和（以空气中的氧浓度为１００％的条件下生存,一旦氧分压超过１８％氧饱和,其活性即受抑制,但该抑制是可逆的[１９‐２０].厌氧氨氧化菌的最佳生长pH范围为６畅７～８畅３,最佳生长温度范围为２０～４３℃[７].厌氧氨氧化菌对氨和亚硝酸的亲和力常数都低于１×
１０－４gN爛L－１[１９].基质浓度过高会抑制厌氧氨氧化菌活性[１９,２１]（表２.
表2 基质对厌氧氨氧化菌的抑制浓度
Table２ Inhibitionconcentrationsofnitrogenoussubstratesonanammoxbacteriammol爛L－１
基 质抑制浓度半抑制浓度NH４＋‐N７０５５
NO２－‐N７２５
注:
半抑制浓度代表抑制５０％厌氧氨氧化活性的基质浓度.
１９９７年,vandeGraff等[２２]基于１５N示踪研究,提出了厌氧氨氧化菌代谢模型（图２;
基于厌氧氨氧化菌基因组学和酶学研究,其他研究者[２３,６]对此代谢模型作了修正（图３.２种模型的最大区别在于:
前者认为亚硝酸的还原产物是羟氨（NH２OH,后者则认为亚硝酸的还原产物是NO.根据改进的模型,亚硝酸先被含有细胞色素c（CytC和细胞色素d１的亚硝酸还原酶（NiR还原成一氧化氮（NO２－＋e－NO;
再由联氨水解酶（HH将一氧化氮与氨结合成联氨（NO＋NH４＋＋３e－N２H４;
最后由联氨氧化酶（HZO或羟氨氧化还原酶（HAO将联氨氧化成氮气（N２H４N２＋４e－.在联氨氧化成氮气的过程中,可产生４个电子,这４个电子通过细胞色素c、泛醌、细胞色素bc１复合体以及其他细胞色素c传递给NiR和HH,其中３个电子传递给NiR,１个电子传递给HH.伴随电子传递,质子被排放至厌氧氨氧化体膜外侧,在该膜两侧形成质子梯度,驱动ATP合成[２３‐２８
图2 基于15N示踪研究的代谢途径
Fig.２ Metabolicpathwaybasedon１５Nstudy
HAO和HZO是厌氧氨氧化菌中研究的较为深入的２种酶.HAO广泛存在于好氧氨氧化细菌、反硝化细菌等微生物中,它不但能够催化羟氨氧化成亚硝酸,也能够将亚硝酸还原为羟氨,还能催化氧化联氨[１].从厌氧氨氧化菌中分离获得的HAO不同于从好氧氨氧化细菌中获得的HAO,它不能将羟氨转化成亚硝酸,只能将其转化成NO或N２O.已被纯化的HAO有２种,虽然两者的分子量和亚单位不同,但是均含大量c型血红素[１６个和（２６±
４个]和P４６８细胞色素.该酶也能催化氧化联氨,
浙江大学学报（农业与生命科学版
但对羟氨的亲和力更强[２４,２６
]
（表３.HZO也已从厌氧氨氧化菌中分离纯化,它只能催化氧化联氨,不能催化氧化羟氨.但羟氨能与该酶结
合,从而对联氨产生竞争性抑制[２５
图3 基于基因组学和酶学的代谢途径
Fig.３ Metabolicpathwaybasedongenomicsandenzymology
表3 厌氧氨氧化菌HAO和HZO酶的特性
Table３ CharacteristicsofHAOandHZOpurifiedfromanammoxbacteria
性 质Brocadiaanammoxidans
HAOKSU‐１菌株
HZOHAO分子质量/ku１８３±
１２１３０±
１０１１８±
１０亚单位/ku５８６２５３组成形态α３α２α２血红素含量２６±
４１６１６细胞色素P４６８
P４７２P４６８氧化活性NH２OHμmax/（μm爛min－１
爛mg－１
２１aND９畅６aKm,Ki/μm２６a（Km２畅４b（Ki３３a（Km周转次数/min－１３畅９×
１０３
NDNRN２H
４
μmax/（μm爛min－１爛mg－１
１畅１a６畅２b０畅５４akm/μm
１８a５畅５b２５a周转次数/min－１
２畅０×
１０２
１畅７×
NR
a以PBS和MTT为电子受体;
b
以细胞色素c为电子受体;
ND:
未检出;
NR:
未报道.
1畅5 生态学特征
目前发现的厌氧氨氧化菌有５个属,９个种[１８
]（图４.
待定厌氧氨氧化布罗卡地菌（CandidatusBrocadiaanammoxidans"
待定荧光布罗卡地菌（CandidatusBrocadiafulgida"
待定斯图加特库氏菌（CandidatusKueneniastuttgartiensis"
待定布罗达氏阶梯烷菌
（CandidatusScalinduabrodae"
待定韦格氏阶梯烷菌（CandidatusScalinduawagneri"
待定亚洲杰特氏菌（CandidatusJetteniaasiatica"
待定丙酸厌氧氨氧化球菌（CandidatusAnammoxoglobuspropionicus"
待定硫酸盐厌氧氨氧化球菌（CandidatusAnammoxoglobus
sulfate"
分离自污水处理厂构筑物或实验室反
应器内[１７,２９‐３４]
;
待定黑海阶梯烷菌（CandidatusScalinduasorokinii"
分离自海水中[３５
].检测表明,厌氧氨氧化菌也存在于海岸、浅滩、入河口的
底泥中.厌氧氨氧化菌的分布极其广泛[３６‐３８]
. 由于厌氧氨氧化同时需要氨和亚硝酸２种基质,在实验室反应器中或在污水厂构筑物中,当溶解氧浓度较低时,厌氧氨氧化菌可与好氧氨氧化菌共同存在,互惠互利.好氧氨氧化菌产生的亚硝酸用作厌氧氨氧化菌的基质,而厌氧氨氧化菌消耗亚硝酸,则可解除亚硝酸对好氧
６
７４第３５卷
郑平,张蕾,等:
厌氧氨氧化菌的特性与分类氨氧化菌的抑制[３９
对厌氧氨氧化菌的生态学研究主要依赖分子生物学手段,其中包括聚合酶链式反应（PCR、
变性梯度凝胶电泳（DGGE、克隆测序和荧光原位杂交（FISH.在厌氧氨氧化菌生态
学研究中常用的PCR引物[１７,３７,４０‐４２]
列于表
４.
图4 厌氧氨氧化菌的系统发育树
Fig.４ Phylogenetictreeofanammoxbacteria
表4 研究厌氧氨氧化菌生态学常用的PCR引物
Table４ PCRprimersusuallyusedinecologicalresearchofanammoxbacteria
目标菌群
上游引物名称
上游引物序列
下游引物名称下游引物序列
Pla４６F
５‐GACTTGCATGCCTAATCC‐３细菌通用引物６３０R
５‐CAKAAAGGAGGTGATCC‐３
浮霉状菌
Pla４６F５‐GACTTGCATGCCTAATCC‐３细菌通用引物１４０６R５‐ACGGGCGGTGTGTRC‐３Pla４６F５‐GACTTGCATGCCTAATCC‐３细菌通用引物１３９２R５‐ACGGGCGGTGTGTAC‐３厌氧氨氧化菌
Amx３６８F５‐CCTTTCGGGCATTGCGAA‐３细菌通用引物１３９２R５‐ACGGGCGGTGTGTAC‐３
Amx３６８F
５‐CCTTTCGGGCATTGCGAA‐３Amx８２０R５‐AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC‐３Amx８０９F５‐GCCGTAAACGATGGGCACT‐３
Amx１０６６R
５‐AACGTCTCACGACACGAGCTG‐３Amx８１８F
５‐ATGGGCACTMRGTAGAGGGGTTT‐３Amx１０６６R
５‐AACGTCTCACGACACGAGCTG‐３
２ 厌氧氨氧化菌的分类
浮霉状菌目（Planctomycetales是细菌域中分化较早的一个分支.该目包括２个科,９个属,分别为Planctomyces,Pirellula,Gemmata,Isosphaera,CandidatusBrocadia,CandidatusKuenenia,CandidatusScalindua,CandidatusJettenia,CandidatusAnammoxoglobus.其中,前４个属归入浮霉状菌科（Planctomycetaceae,皆为化能异养型好氧菌,后５个属归入厌氧氨氧化菌科（Anammoxaceae,皆为化能自养型厌氧菌,并具有厌氧氨氧化功能
[４３‐４４]
2畅1 CandidatusBrocadiaanammoxidans 该种发现于荷兰Gist‐Brocades污水处理
厂,名字中的Brocadia"
、
anammoxidans"
分别图5 CandidatusBrocadiaanammoxidans菌落的电
子显微镜照片
Fi
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