厌氧氨氧化菌的特性与分类图文精Word文档下载推荐.docx

1、 形态 ; 生理 ; 生化 ; 种类 中图分类号 :Q . ;X 文献标志码 :AZ H E N G Pi ng ,Z H A N G L ei （D e p art m ent o f E nvi r onm ent al E n g i neeri ng ,Col l e g e o f E nvi r onm ent al and R es our ce Sci ences ,Z he j i ang U ni ver si t y ,H an g zhou 310029,C hi na ）C haract er i zat i on and cl as s i f i cat i on

2、 of anaer obi c am m oni um oxi dat i on （anam m ox bact er i a . Jour nal of Zhej i ang U ni ver si t y （A gr i c 畅&Li f e Sci 畅 , , （ :A bst r act:A naer obi c am m oni umoxi dat i on （anam m ox i s one of i m port ant di scover i es i n bot henvi r onm ent aland m i cr obi ol ogi cal f i el ds .I

3、 t suppl em ent s bi ogeochem i st r y of ni t r ogen cycl e i n nat ur e , ext ends m i cr obi al di ver si t y and ur ges devel opm ent of novel ni t r ogen r em oval bi ot echnol ogy .R ecent l y , p lent y br eakt hr oughs have been m ade i n t he r esear ch of anam m ox bact er i a .T hei r pr

4、opert i es i n bact er i al m or phol ogy , cyt ochem i st r y , enr i chm ent and i sol at i on , physi ol ogy and bi ochem i st r y , ecol ogy w er e r eveal ed ,and pr obabl e m et abol i c m odel s w er e pr oposed ,and t he i m port ant enzym es w er e pur i f i ed and char act er i zed .A f am

5、 i l y of A nam m oxaceae i ncl udi ng f i ve genus ,ni ne speci es has been est abl i shed .T hi s p aper is a syst em at i c r evi ew i n t he f eat ur es of anam m ox bact er i a and t he ni ne i dent i f i ed speci es . K ey w or ds :anam m ox bact er i a ;m or phol ogy ;physi ol ogy ;bi ochem i

6、 st r y ;speci es在厌氧条件下 , 以亚硝酸盐作为氧化剂将氨氧化成氮气的生物反应称为厌氧氨氧化 . 年 , 由荷兰 M ul der 等 首先在一个处理酵母废 水的反硝化中试装置内发现该反应过程 . 此后 , 人们陆续在海洋 、河流 、湖泊底泥等自然环境中 检测出厌氧氨氧化反应 , 并认为它在氮素生物地球化学循环中起着举足轻重的作用 . 据估计 , 其氮气产量占海洋氮气释放量的 . 在环境工程上 , 厌氧氨氧化反应已成功地应用于 废水生物脱氮处理 . 据报道 , 在荷兰鹿特丹污水处理厂 , 利用厌氧氨氧化工艺对污泥压滤液进行 脱氮处理 , 反应器总氮去除率高达 . kg 爛 m

7、 爛d, 显示了诱人的应用前景 . 厌氧氨氧化的推动者 厌氧氨氧化菌是一群分支很深的浮霉 状菌 , 其特殊的细胞结构 、代谢方式和进化地位 引起了生物学家的高度关注 . 本文拟就厌氧氨氧 化菌的研究进展作一综述 .厌氧氨氧化菌的特性1畅1个体形态特征cw :细胞壁 ;cm :细胞膜 ;pa :外室细胞质 ;i cm :胞 质内膜 ;r i :核糖细胞质 ;am :厌氧氨氧化体膜 ;a :厌氧氨 氧化体 . 长箭头 :管状结构 ; 短箭头 :电子密集颗粒 .图 1厌氧氨氧化菌细胞的超微结构图Fi g . U l trastruct ure of anam m ox bact er i al ce

8、l l厌氧氨氧化菌形态多样 , 呈球形 、卵形等 , 直径 畅畅m . 厌氧氨氧化菌是革兰氏 阴性菌 . 细胞外无荚膜 . 细胞壁表面有火山口状 结构 , 少数有菌毛 . 细胞内分隔成 部分 :厌氧氨氧化体 （anam m oxosom e 、核糖细胞质 （r ibopl asm 及外室细胞质 （p aryphopl asm . 核 糖细胞质中含有核糖体和拟核 , 大部分 D N A 存在于此 . 该菌出芽生殖 .厌氧氨氧化体是厌氧氨氧化菌所特有的结 构 , 占细胞体积的 , 厌氧氨氧化反 应在其内进行 . 厌氧氨氧化体由双层膜包围 ,该膜深深陷入厌氧氨氧化体内部 （图 . 厌 氧氨氧化体不含

9、核糖体 , 但含六角形的管状结 构和电子密集颗粒 . 透射电镜及能谱仪分析表明 , 这些电子密集颗粒中含有铁元素 .1畅2细胞壁和细胞膜化学组分特征厌氧氨氧化菌的细胞壁主要由蛋白质组成 , 不含肽聚糖 . 细胞膜中含有特殊的阶梯烷膜脂 ,由多个环丁烷组合而成 , 形状类似阶梯 . 在各 种厌氧氨氧化菌中 , 阶梯烷膜脂的含量基本相 似 . 疏水的阶梯烷膜脂与亲水的胆碱磷酸 、乙醇 胺磷酸或甘油磷酸结合形成磷脂 , 构成细胞膜的 骨架 . 细胞膜中的非阶梯烷膜脂由直链脂肪酸 、支链脂肪酸 、单饱和脂肪酸和三萜系化合物组 成 . 三 萜系 化 合 物 包 括 C 的 藿 烷 类 化 合 物（hop

10、anoid , 细 菌 藿 四 醇 （bact er i ohopanet et r ol, B H T 和鲨烯 （s qual ene ,C H . 其中 , B H T 首 次发现于严格厌氧菌中 . 在不同厌氧氨氧化 菌种中 , 非阶梯烷膜脂的种类和含量变化较 大 . 曾一度认为阶梯烷膜脂只存在于厌氧氨 氧化体的双层膜上 , 其功能是限制有毒中间产物 的扩散 . 目前认为阶梯烷膜脂存在于厌氧氨氧化 菌的所有膜结构上 （包括细胞质膜 , 它们与非阶 梯烷膜脂相结合 , 以 确保其他膜结构的穿透性好于厌氧氨氧化体膜 , . 1畅3富集培养与分离特征厌氧氨氧化菌的富集培养选用自然样品作 为接种物

11、 （如活性污泥 、海洋底泥 、土壤 , 按目 标菌群所需的最佳生境条件 , 以含有适量基质 和营养元素的培养液 （表 在生物反应器中进 行 . 厌氧氨氧化菌生长缓慢 , 倍增时间 d . 富集培养物呈红色 , 性状粘稠 , 含有较多的胞外多聚物 .厌氧氨氧化菌是一种难培养的微生物 , 采 用系列稀释分离 、平板划线分离 、显微单细胞分 离等传统微生物分离方法 , 均未分离成功 . 迄今 为止 , 密度梯度离心法是成功分离厌氧氨氧化 菌的唯一方法 . 其原理是通过离心使不同密度的细菌细胞形成不同的沉降带 . 具体操作方 法如下 :首先 , 用超声波温和破碎厌氧氨氧化菌 富集培养物 , 将菌群分散

12、成单个细胞 ; 接着 , 离 心去除残留的聚集体 （生物膜或絮体碎片 ; 最 后 , 将分散的细胞用 Per col l 密度梯度离心 , 使 厌氧氨氧化菌在离心管内形成一条深红色条 带 . 采用该方法可获得高纯度的细胞悬液 , 每个细胞中可只含有 个污染细胞 表 1富集厌氧氨氧化菌的营养元素组成 T abl e N ut r i ent s used f or anam m ox bact er i a enr i chm ent营养物 质量浓度 /（g 爛 L K H PO 畅C aC l 畅M gSO 爛 H O 畅K H C O 畅微量元素溶液 E D T A FeSO 微量元素溶液

13、E D T A H B O 畅M nC l 爛 H O 畅C uSO 爛 H O 畅Z nSO 爛 H O 畅N i C l 爛 H O 畅N aM oO 爛 H O 畅N aSeO 爛 H O 畅1畅4生理生化特征厌氧氨氧化菌为化能自养型细菌 , 以二 氧化碳作为唯一碳源 , 通过将亚硝酸氧化成硝 酸来获得能量 , 并通过乙酰 C oA 途径同化二氧 化碳 . 虽然有的厌氧氨氧化菌能够转化丙 酸 、乙酸等有机物质 , 但它们不能将其用作碳 源 . 厌氧氨氧化菌对氧敏感 , 只能在氧分 压低 于 氧 饱 和 （以 空 气 中 的 氧 浓 度 为 的条件下生存 , 一旦氧分压超过 氧 饱和 ,

14、其 活 性 即 受 抑 制 , 但 该 抑 制 是 可 逆 的 . 厌氧氨氧化菌的最佳生长 p H 范围为 畅畅, 最佳生长温度范围为 . 厌氧氨氧化菌对氨和亚硝酸的亲和力常数都低 于 g N 爛 L . 基质浓度过高会抑制 厌氧氨氧化菌活性 , （表 .表 2基质对厌氧氨氧化菌的抑制浓度T abl e Inhi bi t i on concentrat i ons of ni trogenous subst rat es on anam m ox bact er i a m m ol 爛 L 基 质 抑制浓度 半抑制浓度 N H N N O N 注 :半抑 制 浓 度 代 表 抑 制 厌 氧

15、 氨 氧 化 活 性 的 基 质 浓度 .年 , van de G r af f 等 基于 N 示踪 研究 , 提出了厌氧氨氧化菌代谢模型 （图 ; 基 于厌氧氨氧化菌基因组学和酶学研究 , 其他研 究者 , 对此代谢模型作了修正 （图 . 种模 型的最大区别在于 :前者认为亚硝酸的还原产 物是羟氨 （N H O H , 后者则认为亚硝酸的还 原产物是 N O . 根据改进的模型 , 亚硝酸先被含 有细胞色素 c（C yt C 和细胞色素 d 的亚硝酸 还原酶 （N i R 还原成一氧化氮 （N O e N O ; 再由联氨水解酶 （H H 将一氧化氮与氨 结合成联氨 （N O N H e N

16、 H ; 最 后由联氨氧化酶 （H ZO 或 羟氨氧化还原酶 （H A O 将联氨氧化成氮气 （N H N e . 在联氨氧化成氮气的过程中 , 可产生 个电子 , 这 个电子通过细胞色素 c 、泛醌 、细 胞色素 bc 复合体以及其他细胞色素 c 传递给 N i R 和 H H , 其中 个电子传递给 N i R , 个电 子传递给 H H . 伴随电子传递 , 质子被排放至厌 氧氨氧化体膜外侧 , 在该膜两侧形成质子梯度 , 驱动 A T P 合成 图 2基于 15N 示踪研究的代谢途径Fi g . M et abol i c pat hw ay based on N st udyH A

17、O 和 H ZO 是厌氧氨氧化菌中研究的 较为深入的 种酶 . H A O 广泛存在于好氧氨 氧化细菌 、反硝化细菌等微生物中 , 它不但能够 催化羟氨氧化成亚硝酸 , 也能够将亚硝酸还原 为羟氨 , 还能催化氧化联氨 . 从厌氧氨氧化菌 中分离获得的 H A O 不同于从好氧氨氧化细菌 中获得的 H A O , 它不能将羟氨转化成亚硝酸 , 只能 将 其 转 化 成 N O 或 N O . 已 被 纯 化 的 H A O 有 种 , 虽然两者的分子量和亚单位不 同 , 但是均含大量 c 型血红素 个和 （ 个 和 P 细胞色素 . 该酶也能催化氧化联氨 ,浙江大学学报 （农业与生命科学版 但

18、对羟氨的亲和力更强 , （表 . H ZO 也已 从厌氧氨氧化菌中分离纯化 , 它只能催化氧化 联氨 , 不能催化氧化羟氨 . 但羟氨能与该酶结合 , 从而对联氨产生竞争性抑制 图 3基于基因组学和酶学的代谢途径Fi g . M et abol i c pat hw ay based on genom i cs and enzym ol ogy表 3厌氧氨氧化菌 H A O 和 H ZO 酶的特性T abl e C haract er i st i cs of H A O and H Z O pur i f i ed from anam m ox bact er i a性 质 B rocadi

19、 a anam m oxidansH A O K SU 菌株H Z O H A O 分子质量 /ku 亚单位 /ku 组成形态 血红素含量 细胞色素 P P P 氧化活性 N H O H m ax /（m 爛 m i n 爛 m g a N D 畅a K m , K i /m a （K m 畅b （K i a （K m 周转次数 /m i n 畅N D N R N Hm ax /（m 爛 m i n 爛 m g 畅a 畅b 畅a k m /ma 畅b a 周转次数 /m i n 畅畅N Ra 以 PB S 和 M T T 为电子受体 ; b以细胞色素 c 为电子受体 ; N D :未检出 ;

20、N R :未报道 .1畅5生态学特征目前发现的厌氧氨氧化菌有 个属 , 个 种 （图 .待 定 厌 氧 氨 氧 化 布 罗 卡 地 菌 （C andi dat usBr ocadi a anam m oxi dans ,待定荧 光布罗卡地菌 （C andi dat us Br ocadi a f ul gi da , 待 定 斯 图 加 特 库 氏 菌 （C andi dat us K ueneni a st ut t gar t i ens i s , 待 定 布 罗 达 氏 阶 梯 烷 菌（C andi dat usScal i ndua br odae待定韦格氏阶 梯烷菌 （C andi

21、 dat us Scal i ndua w agner i , 待定 亚洲杰特氏 菌 （C andi dat us J et t eni a as i at i ca待 定 丙 酸 厌 氧 氨 氧 化 球 菌 （C andi dat us A nam m oxogl obus pr opi oni cus , 待定硫酸盐厌 氧氨 氧 化 球 菌 （C andi dat us A nam m oxogl obussul f at e 分离自污水处理厂构筑物或实验室反应器内 , ;待定黑海阶梯烷菌 （C andi dat us Scal i ndua s or oki ni i 分离自海水中 .

22、检测表 明 , 厌氧氨氧化菌也存在于海岸 、浅滩 、入河口的底泥中 . 厌氧氨氧化菌的分布极其广泛 . 由于厌氧氨氧化同时需要氨和亚硝酸 种 基质 , 在实验室反应器中或在污水厂构筑物中 , 当溶解氧浓度较低时 , 厌氧氨氧化菌可与好氧 氨氧化菌共同存在 , 互惠互利 . 好氧氨氧化菌产 生的亚硝酸用作厌氧氨氧化菌的基质 , 而厌氧 氨氧化菌消耗亚硝酸 , 则可解除亚硝酸对好氧第 卷 郑 平 , 张 蕾 , 等 :厌氧氨氧化菌的特性与分类 氨氧化菌的抑制 对厌氧氨氧化菌的生态学研究主要依赖分 子生物 学 手 段 , 其 中 包 括 聚 合 酶 链 式 反 应 （PC R 、变性梯度凝胶电泳 （

23、D G G E 、克隆测序 和荧光原位杂交 （FI S H . 在厌氧氨氧化菌生态学研究中常用的 PC R 引物 , , 列于表.图 4厌氧氨氧化菌的系统发育树Fi g . P hyl ogenet i c t ree of anam m ox bact er i a表 4研究厌氧氨氧化菌生态学常用的 PC R 引物T abl e PC R pr i m ers usual l y used i n ecol ogi cal research of anam m ox bact er i a目标菌群上游引物名称上游引物序列下游引物名称 下游引物序列Pl a F G A C T T G C A

24、T G C C TA A T C C 细菌通用引物 R C A K A A A G G A G G T G A T C C 浮霉状菌Pl a F G A C T T G C A T G C C TA A T C C 细菌通用引物 R A C G G G C G G T G T G T R C Pl a F G A C T T G C A T G C C TA A T C C 细菌通用引物 R A C G G G C G G T G T G TA C 厌氧氨氧化菌A m x F C C T T T C G G G C A T T G C G A A 细菌通用引物 R A C G G G C G

25、G T G T G TA C A m x F C C T T T C G G G C A T T G C G A A A m x R A A A A C C C C T C TA C T TA G T G C C C A m x F G C C G TA A A C G A T G G G C A C T A m x R A A C G T C T C A C G A C A C G A G C T G A m x F A T G G G C A C T M R G TA G A G G G G T T T A m x R A A C G T C T C A C G A C A C G A G

26、 C T G 厌氧氨氧化菌的分类浮霉状菌目 （Pl anct om ycet al es 是细菌域中 分化较早的一个分支 . 该目包括 个科 , 个属 , 分 别 为 Pl anct om y c e s, Pi r el l ul a , G em m at a , I s os p haera , C andi dat us Br ocadi a , C andi dat us K ueneni a , C andi dat us Scal i ndua , C andi dat us J et t eni a ,C andi dat us A nam m oxogl obus . 其中 , 前 个属归入浮霉状菌科 （Pl anct om ycet aceae , 皆 为化能异养型好氧菌 , 后 个属归入厌氧氨氧化 菌科 （A nam m oxaceae , 皆为化能自养型厌氧菌 , 并具有厌氧氨氧化功能2畅1C andi dat us B r ocadi a anam m oxi dans 该种发现于荷兰 G i st B r ocades 污水处理厂 , 名字中的 B r ocadi a 、anam m oxi dans 分别 图 5C andi dat us B r ocadi a anam m oxi dans 菌落的电子显微镜照片Fi