蛇床子素在Caco2 细胞模型中的转运机制研究Word下载.docx

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Osthol；

Caco-2细胞模型；

Verapamil；

微粒体；

HPLC

StudyonTransportMechanismsofOstholinCaco-2CellModel

ZhentingYuan1，2,KeWang2,MingHu1（1DepartmentofPharmacologicalandPharmaceuticalSciencesofCollegeofPharmacyofuniversityofHouston，TX，Houston77030；

2No230HospitalinDandong，Liaoning，Dandong118000，China）

ABSTRACT:

OBJECTIVETostudythetransportmechanismsofostholbyusingCaco-2cellmodel.METHODSEffectofconcentration,PEG600,verapamil（P-gpinhibitor）andtemperatureontransportofostholinCaco-2cellmodelwasstudied.RESULTSAmounttransportedofostholintheapical（AP）tobasolateral（BL）directioninCaco-2cellcellmodelincreasedwithloadingconcentrationandtemperatureheightened.PEG600enhancestherateofostholtransport.ThePAPandPBLofostholinCaco-2modelwerenotaffectedbyverapamil.CONCLUTIONPAPofostholinCaco-2modelwasmorethan10×

10-6andostholwasabsorbedeasilybyCaco-2cell.Further,therewerenosignificantlydifferencesintheratiosofPBLtoPAPatthreeconcentrations,activationenergyisquitemoderateat4.14Kcal/moleand

ThePBLtoPAPofostholtransportwerenotaffectedbyverapamil,suggestingthattheabsorptionisviapassivediffusion.

KEYWORDS:

Osthol；

Caco-2cellmodel；

Verapamil;

Microsomes；

HPLC

中图分类号:

R965　　　文献标识码:

A　　　文章编号

蛇床子素（osthol，OS）是从中药蛇床子[Cnidiummonnieri（L.）cusson]中提取的主要有效成分之一[1,2]，其结构见图1。

图1OS的化学结构

Fig1ChemicalstrutureofOS

据报道在传统中医药中常用于治疗女性生殖器疾病、化脓性皮炎及阳痿，现代文献报道，蛇床子具有抗癌[3-5]、抗过敏[6]、雄性激素样[7]作用，以及预防肝炎[8]和抗菌、抗凝血作用[9]、，但由于蛇床子素的体内生物利用度较低[10-13]，限制了临床使用。

虽然已有关于OS在家兔[10,11]和大鼠[12,13]体内的药动学参数的研究，但关于其吸收代谢的机制研究还没有报道，因此，我们建立了简单、快速、精确及专属性强的液相方法测定I相反应体系（PhaseIreactionsystem）和Caco-2细胞模型中OS的测定方法，用于研究OS在I相反应体系的代谢和Caco-2细胞模型中吸收代谢机制。

1仪器与试剂

1.1仪器HP1090型高效液相色谱仪（美国惠普公司）。

1.2试剂烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐（NADP）、D-葡萄糖-6-磷酸二钠（6-DP）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（6-DPD）、HBSS（Hank’sbalancedsaltsolution,pH7.4）、Dulbecco’sModifiedEagle’s（DMEM）培养基、胎牛血清、7-羟基香豆素、氯化镁（MgCl2）、磷酸（H3PO4）、聚乙二醇600（PEG600）、磷酸氢二钾（K2HPO4）及柠檬酸二钠（美国Sigma公司）；

OS原料，从中药蛇床子中提取，含量99.6%（HPLC测定）；

OS对照品（中国药品生物制品检定所）；

ClonedCaco-2cells（TC7,InstituteNationaldelaSante´

etdelaRecherchezU178,Villejuit,France赠送）；

其他试剂均为分析纯、色谱纯。

2方法

2.1色谱条件色谱柱:

C18柱（Aqua5μm,150×

4.6mm;

Phenomenex,Torrance,CA,USA,）；

紫外检测波长为320nm，流动相为乙腈（流动相A）—0.6%三乙胺和0.45%甲酸缓冲溶液（流动相B,pH2.85）线性梯度洗脱，梯度方法为：

流动相A0-20min，45%-75%;

20-22min，75%；

22min-23min，75%-45%，流速1mL·

min-1，进样240μL。

2.2肝微粒体的制备选取200g-250gSprague-Dawley雄性大鼠按照文献报道的方法[14]制备大鼠肝微粒体（RatLiverMicrosomes,RLM）,采用Bio-Rad（Bio-Radlaboratories,Hercules,CA,USA）法测定大鼠肝微粒体蛋白浓度。

2.3I相反应体系的制备

取2.61mMNADP、6.6mM6-DP和6.6mMMgCl2，溶解在50mL水中，制得溶液A；

精密量取适量6-DPD，加入适量5mM柠檬酸二钠溶液中，使6-DPD终浓度为40U·

ml-1，中，制得溶液B；

10mMK2HPO4溶解在100mL的水中，用H3PO4调pH7.4，制得溶液C（KPI溶液）。

每1mLI相反应体系中含50µ

L溶液A、10µ

L溶液B、适量KPI溶液及适当浓度的肝微粒体（蛋白浓度为0.5mg·

mL–1）。

2.4标准曲线的制备

分别精密称取OS对照品、原料及内标物7-羟基香豆素（internalstandard，IS），分别用乙腈溶解并稀释成适宜浓度的溶液（内标液浓度为3μg·

mL–1）；

精密量取OS对照品溶液，用HBSS稀释成系列浓度约为60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94和0.47μM的对照品溶液,分别精密量取0.4mL，然后加入IS液0.4mL，旋涡0.5min,15000r·

min-1离心15min，取上清液240μL注入高效液相仪进行测定。

2.5OS溶液在Caco-2细胞模型中的转运和代谢

2.5.1细胞培养Caco-2细胞培养条件按文献操作[15-17]，种植密度为1×

106/cm2（单层），面积为4.2cm2/每孔（单层），置37°

C、5%CO2孵箱培养，每隔1天更换含10%胎牛血清的DMEM培养基，质量控制标准按文献操作[18]，细胞培养19-22天用于实验。

2.5.2不同浓度的OS溶液在Caco-2细胞模型中的转运和代谢转运方法按文献操作[15]，用37°

C2.5mLHBSS（pH7.4）冲洗单层细胞3次，跨膜电阻（TEER）被测定不小于420Ω/cm2。

将OS用乙腈溶解并稀释成适宜浓度，再分别用HBSS将OS乙腈溶液稀释成5、10、15μM的溶液，然后将不同浓度的OS溶液或HBSS分别加在细胞顶侧（AP，apical）或基底侧（BL,basolateral）,体积分别为2.5mL,置37°

C孵箱培养，分别在0、0.5、1、1.5、2和3h在细胞的供给或接收池取样0.4mL，同时在细胞的供给或接收池加入相同体积的OS样品或HBSS，样品分别加0.4mL内标溶液，旋涡0.5min，15000r·

min-1离心15min,照“2.4”项下进行测定。

2.5.3PEG600对OS转运的影响分别用0.5%PEG溶液将OS乙腈溶液稀释成15μMOS溶液，然后将0.5%PEG60015μMOS的溶液加入AP侧，BL侧加入HBSS,体积分别为2.5mL,以“2.4”项下考察PEG对OS转运的影响。

2.5.4P-gp抑制剂verapamil[19，20]对OS转运的影响将含10μMverapamil的HBSS分别加入供给池和接收池中，37℃共浴20min。

弃去培养液，用HBSS配制成含10μMverapamil的15μMOS溶液。

以“2.4”项下考察P-gp抑制剂对OS转运的影响。

2.5.5温度对OS在Caco-2细胞模型中转运的影响

将10μM的OS溶液分别在4、25和37℃温度下，以“2.4”项下考察在Caco-2细胞模型中转运情况。

2.5.6OS在Caco-2细胞模型中BL侧含有I相反应体系中的转运和代谢将10μMOS溶液加入Caco-2细胞模型的AP侧，BL侧加入I相反应体系，体积分别为2.5mL，以“2.4”项下考察OS转运情况。

3结果

3.1Caco-2细胞的完整性形态学检查可观察到完整的单层上皮细胞，细胞间连接紧密，细胞具有不对称性，融合成连续的单细胞层。

这些细胞与小肠上皮细胞极为相似，实验前后TEER值均为460-500之间，Caco-2细胞具有良好的完整性，适合于药物转运实验。

3.2分析方法的专属性考察分别取“2.5.2”和“2.5.6”项下样品，同样方法处理I相反应体系和HBSS的空白样品，照“2.4”项下进行测定，实验结果表明，空白样品仅含有溶剂峰，“2.5.2”项下样品含有OS和IS的色谱峰，“2.5.6”项下样品除溶剂峰、OS和IS的色谱峰外，又增加了4个色谱峰（M1,M2,M3,M4），结果见图2。

I.S.,M1,M2,M3,M4和OS的保留时间分别是4.7,7.,7.9,10.2,10.7and18.9min，OS、IS及M1,M2,M3,M4有较好的分离度，没有干扰物质存在，实验结果表明本测定方法具有较好的专属性。

图2A-OS和IS在I相反应体系中色谱图；

B-OS和IS在灭活的I相反应体系和Caco-2

细胞模型中色谱图；

C-空白I相反应体系中色谱图；

D-空白HBSS中色谱图。

Fig.2A-RepresentativeHPLCchromatogramsofOSandISinphaseIreactionsystem；

B-OSandISininactivatedphaseIreactionsystemandCaco-2cellmodel；

C-blankphaseIreactionsystem；

D-AndblankHBSS。

3.3标准曲线的线性、最低检测量（LLOD）和最低定量限（LLOQ）采用加权最小二乘法,以OS与内标的峰面积比对OS浓度作标准曲线。

结果OS在0.47μM～60μM范围内，OS在Caco-2细胞模型中的回归方程为:

y=0.0332x-0.0069（r=0.9992），线性关系良好，最低检测量（LLOD）和最低定量限（LLOQ）分别是0.2μM和0.47μM。

3.4回收率和精密度试验在HBSS中分别加入高、中、低3种不同浓度的OS溶液，使其终浓度为1.5、30和60μM，照“2.4”项下进行处理测定，结果见表1，从表1中看出，其日内和日间精密度分别不大于4.09%和4.73%。

表1OS测定的回收率和精密度试验结果（n=6）

Tab.1Resultsofrecoveryandprecision（n=6）

3.5稳定性试验在HBSS中加入OS溶液,使其终浓度为15μM,于37°

C孵育箱中放置，分别于0、4、8、12及24h，照“2.4”项下进行处理测定，结果表明样品在72h内稳定。

3.6不同浓度的OS溶液对OS在Caco-2细胞模型中转运的影响研究了5、10及15μM三种浓度的OS溶液在Caco-2细胞的转运，见图3、表2，结果表明，随着OS溶液浓度的增加，AP-BL的转运量增加，OS表观通透系数PAP和PBL较高（>

10×

10-6），表明OS容易被吸收[21，22]，但3个浓度的PAP和PBL比值无明显变化，OS的吸收可能是被动吸收。

图3不同OS浓度溶液对OS在Caco-2细胞转运的影响（n=3）.

Fig.3EffectsofdifferentconcentrationsontransportofOSacrossCaco-2cellmonolayer（n=3）.

表2不同OS浓度溶液的OS表观通透系数（n=3）

Table2.PappofOSofdeferenceconcentrationsofOSsolutionacrossCaco-2cellmodel（n=3）

3.7PEG600对OS在Caco-2细胞模型中转运的影响将0.5%PEG60015μMOS的溶液加入AP侧，BL侧加入HBSS考察OS在Caco-2细胞模型中转运情况，结果表明，含0.5%PEG60015μMOS溶液AP-BL的转运量和15μMOS溶液比较明显增加，可能PEG600是一个表面活性剂，可以使Caco-2细胞的表面张力降低，从而使OS在Caco-2细胞中的转运速度增加，结果见图4。

图4PEG600对OS在Caco-2cell转运的影响（n=3）

Fig4EffectofPEG600ontransportofOSacrossCaco-2cellmonolayer（n=3）

3.8P-gp抑制剂verapamil对OS在Caco-2细胞模型中转运的影响通过考察HBSS配制成含10μMverapamil的15μMOS溶液在Caco-2细胞模型中转运情况，结果表明，加入P-gp抑制剂verapamil后，与不加P-gp抑制剂verapamil的15μMOS溶液相比，在Caco-2细胞表观通透系数PAP和PBL无显著差异，见图5。

图5P-gp抑制剂verapamil对OS在Caco-2细胞转运的影响（n=3）

Fig5EffectofP-gpinhibitorsofverapamilontransportofOSacrossCaco-2cellmonolayer（n=3）

3.9不同浓度的OS溶液对OS在Caco-2细胞模型中转运速度的影响比较不同浓度的OS溶液的OS平均透过Caco-2细胞的转运速度，结果见图6。

图6各种溶液OS透过Caco-2细胞的转运速度（n=3）

Fig6RateoftransportofOSofdifferencesolutionacrossCaco-2cellmonolayer（n=3）

试验结果表明，随着OS溶液浓度的增加，OS透过Caco-2细胞的转运速度增加，含0.5%

PEG60015μMOS溶液转运速度与其他溶液相比有显著性差异（P<

0.01）。

3.10OS在Caco-2细胞模型BL侧含有I相反应体系的转运和代谢为模拟I相反应体系对OS生物利用度的动力学影响，我们分别测定了10μMOS溶液在Caco-2细胞模型中的转运和在Caco-2细胞模型BL侧加入I相反应体系的转运，BL侧OS的含量分别为13.51±

0.32和8.33±

0.37nmol，结果见图7，后者OS的转运量明显降低，表明后者当OS穿过Caco-2细胞后被I相反应体系快速代谢，同时检测到4个主要代谢产物（M1,M2,M3,M4，见图2A）。

图7Caco-2细胞模型BL侧含有I相反应体系对OS转运和代谢的影响（n=3）

Fig.7EffectsofpresenceofaphaseIreactionsystemontheBL

sideonthetransportofOSacrosstheCaco-2cellmodel.

3.7温度对OS在Caco-2细胞模型中转运的影响

以“2.4”项下分别考察10μM的OS溶液在4、25和37℃温度下在Caco-2细胞模型中转运情况，见图8、9，结果表明，随着温度的增加，OS的转运量增加，但活化能较低（4.14Kcal/mole），说明OS的吸收机制可能是被动的[23]。

图8温度对OS在Caco-2细胞模型中转运的影响（n=3）

Fig.8TransportofostholacrossCaco-2cellmodelatdifferenttemperatures（n=3）.

图9温度对OS在Caco-2细胞模型中转运影响的Arrhenius曲线（n=3）

Fig.9ArrheniusplotofeffectsoftemperatureonostholtransportacrossCaco-2cellmodel（n=3）.

4讨论

建立了HPLC-UV方法测定了Caco-2细胞模型中OS的含量，采用线性梯度洗脱OS及其代谢物，达到了理想的分离效果，该方法的具有专属性高，精密度、回收率、灵敏度及线性好的特点。

OS溶液的浓度对OS的在Caco-2细胞模型中转运吸收有着较大的影响，随着OS溶液浓度增加，AP-BL的转运量增加，OS表观通透系数PAP和PBL较高（>

10-6），表明OS容易被吸收[21，22]，但3个浓度的PAP和PBL比值无明显变化，说明OS的吸收可能是被动吸收。

P-gp是一个由多药耐药基因编码的跨膜糖蛋白，为能量依赖性药物外排泵，在体内广泛分布，对药物体内的吸收、分布、代谢和排泄有重要的影响，特别是对P-gp底物口服生物利用度的影响。

Verapamil是常见的第一代P-gp抑制剂[19，20]，本实验结果表明,verapamil对OS在Caco-2细胞中的表观通透系数PAP和PBL无显著影响，说明OS在Caco-2细胞中的吸收转运机制主要是被动扩散。

随着温度的增加，OS的转运量增加，但活化能较低（4.14Kcal/mole），说明OS的吸收机制可能是被动的[23]。

OS在Caco-2细胞模型的转运实验表明，OS容易被吸收，但当Caco-2细胞模型BL侧含有I相反应体系时，OS从AP侧转运到BL侧后被较快的代谢并检测到多个代谢产物，后者的快速代谢可能影响OS的生物利用度；

文献报道[13]分别给予家兔OS胶囊和β-环糊精包合物OS胶囊，前者较后者的生物利用度低，有显著性差异（P<

0.05），这可能是由于OS被β-环糊精包合后提高了OS的吸收量，从而提高了OS的生物利用度。

5参考文献

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（1）:

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