蛇床子素在Caco2 细胞模型中的转运机制研究Word下载.docx

1、Osthol；Caco-2 细胞模型；Verapamil；微粒体；HPLC Study on Transport Mechanisms of Osthol in Caco-2 Cell ModelZhenting Yuan1，2 ,Ke Wang2 , Ming Hu1 （1 Department of Pharmacological and Pharmaceutical Sciences of College of Pharmacy of university of Houston，TX， Houston 77030；2 No 230 Hospital in Dandong，Liaoning

2、，Dandong118000，China）ABSTRACT: OBJECTIVE To study the transport mechanisms of osthol by using Caco-2 cell model. METHODS Effect of concentration, PEG600, verapamil （P-gp inhibitor） and temperature on transport of osthol in Caco-2 cell model was studied. RESULTS Amount transported of osthol in the ap

3、ical （AP） to basolateral （BL） direction in Caco-2 cell cell model increased with loading concentration and temperature heightened. PEG600 enhances the rate of osthol transport. The PAP and PBL of osthol in Caco-2 model were not affected by verapamil. CONCLUTION PAP of osthol in Caco-2 model was more

4、 than 1010-6 and osthol was absorbed easily by Caco-2 cell. Further, there were no significantly differences in the ratios of PBL to PAP at three concentrations, activation energy is quite moderate at 4.14 Kcal/mole and The PBL to PAP of osthol transport were not affected by verapamil, suggesting th

5、at the absorption is via passive diffusion. KEYWORDS: Osthol；Caco-2 cell model；Verapamil; Microsomes；HPLC中图分类号:R965 文献标识码:A 文章编号 蛇床子素（osthol，OS）是从中药蛇床子Cnidium monnieri （L.） cusson中提取的主要有效成分之一1,2，其结构见图1。图 1 OS的化学结构Fig 1 Chemical struture of OS据报道在传统中医药中常用于治疗女性生殖器疾病、化脓性皮炎及阳痿，现代文献报道，蛇床子具有抗癌3-5、抗过敏6、雄性激

6、素样7作用，以及预防肝炎8和抗菌、抗凝血作用9、，但由于蛇床子素的体内生物利用度较低10-13，限制了临床使用。虽然已有关于 OS 在家兔10,11和大鼠12,13体内的药动学参数的研究，但关于其吸收代谢的机制研究还没有报道，因此，我们建立了简单、快速、精确及专属性强的液相方法测定I相反应体系（Phase I reaction system）和 Caco-2 细胞模型中OS 的测定方法，用于研究 OS 在I相反应体系的代谢和 Caco-2 细胞模型中吸收代谢机制。1 仪器与试剂 1.1 仪器 HP1090型高效液相色谱仪（美国惠普公司）。1.2 试剂 烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐 （NADP）

7、、D-葡萄糖-6-磷酸二钠（6-DP）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（6-DPD）、HBSS （Hanks balanced salt solution, pH 7.4） 、Dulbeccos Modified Eagles （DMEM） 培养基、胎牛血清、7-羟基香豆素、氯化镁（MgCl2）、磷酸（H3PO4）、聚乙二醇600（PEG600）、磷酸氢二钾 （K2HPO4） 及柠檬酸二钠 （美国Sigma 公司） ；OS 原料，从中药蛇床子中提取，含量99.6%（HPLC测定）；OS 对照品（中国药品生物制品检定所）；Cloned Caco-2 cells （TC7, Institute Natio

8、nal de la Sante et de la Recherchez U 178, Villejuit, France 赠送） ；其他试剂均为分析纯、色谱纯。 2 方法2.1 色谱条件 色谱柱: C18柱 （Aqua 5 m, 150 4.6 mm;Phenomenex, Torrance, CA, USA,） ； 紫外检测波长为320 nm，流动相为乙腈 （流动相A）0.6% 三乙胺和 0.45%甲酸缓冲溶液（流动相B, pH 2.85）线性梯度洗脱，梯度方法为：流动相A 0-20 min， 45%-75%; 20-22 min， 75%；22 min -23 min，75%-45%，流速

9、1 mLmin- 1，进样240 L。2.2 肝微粒体的制备 选取200 g-250 g Sprague-Dawley 雄性大鼠按照文献报道的方法 14 制备大鼠肝微粒体 （Rat Liver Microsomes,RLM）, 采用 Bio-Rad（Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA） 法测定大鼠肝微粒体蛋白浓度。2.3 I相反应体系的制备 取2.61 mM NADP 、6.6 mM 6-DP和6.6 mM MgCl2，溶解在50 mL水中，制得溶液A；精密量取适量6-DPD ，加入适量5 mM柠檬酸二钠溶液中，使6-DPD终浓度为40 Uml-1，

10、中，制得溶液B；10 mM K2HPO4溶解在100 mL的水中，用H3PO4调pH 7.4，制得溶液C（KPI溶液）。每1 mL I相反应体系中含50 L溶液A、10 L溶液B、适量KPI溶液及适当浓度的肝微粒体（蛋白浓度为0.5 mgmL 1）。2.4 标准曲线的制备分别精密称取 OS 对照品、原料及内标物7-羟基香豆素 （internal standard，IS） ，分别用乙腈溶解并稀释成适宜浓度的溶液（内标液浓度为3 gmL 1）；精密量取 OS 对照品溶液，用 HBSS稀释成系列浓度约为60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94和0.47 M的对照品溶液, 分别精密量取0

11、.4 mL，然后加入 IS 液0.4 mL，旋涡0.5 min, 15000 rmin - 1离心15 min ，取上清液240 L注入高效液相仪进行测定。2.5 OS溶液在 Caco-2 细胞模型中的转运和代谢2.5.1细胞培养 Caco-2细胞培养条件按文献操作 15-17 ，种植密度为1106/cm2（单层），面积为4.2 cm2/每孔（单层），置37 C、5% CO2 孵箱培养，每隔1天更换含10%胎牛血清的 DMEM 培养基，质量控制标准按文献操作 18，细胞培养19-22天用于实验。2.5.2 不同浓度的OS溶液在Caco-2 细胞模型中的转运和代谢 转运方法按文献操作 15 ，用

12、37 C 2.5 mL HBSS （pH 7.4）冲洗单层细胞3次，跨膜电阻（TEER）被测定不小于420 /cm2。将 OS 用乙腈溶解并稀释成适宜浓度，再分别用 HBSS 将 OS 乙腈溶液稀释成5、10、15 M 的溶液，然后将不同浓度的 OS 溶液或 HBSS 分别加在细胞顶侧（AP，apical）或基底侧（BL,basolateral）, 体积分别为2.5 mL,置 37 C孵箱培养，分别在0、0.5、1、1.5、2和3 h在细胞的供给或接收池取样0.4 mL，同时在细胞的供给或接收池加入相同体积的 OS 样品或 HBSS，样品分别加0.4 mL内标溶液，旋涡0.5 min，1500

13、0 r min - 1离心15 min , 照“2.4”项下进行测定。2.5.3 PEG600对OS转运的影响 分别用0.5% PEG溶液将OS乙腈溶液稀释成15 M OS 溶液，然后将0.5% PEG600 15 M OS的溶液加入AP侧， BL侧加入HBSS, 体积分别为2.5 mL, 以“2.4”项下考察PEG对OS转运的影响。2.5.4 P-gp抑制剂verapamil 19，20 对OS转运的影响 将含10 M verapamil 的HBSS 分别加入供给池和接收池中， 37 共浴20 min。弃去培养液，用 HBSS 配制成含10 M verapamil 的15 M OS溶液。以“

14、2.4”项下考察 P-gp 抑制剂对 OS 转运的影响。2.5.5 温度对OS在Caco-2 细胞模型中转运的影响将10 M 的 OS 溶液分别在4、25和37 温度下，以“2.4”项下考察在 Caco-2 细胞模型中转运情况。2.5.6 OS在Caco-2 细胞模型中BL侧含有I相反应体系中的转运和代谢 将10 M OS溶液加入Caco-2细胞模型的 AP 侧， BL 侧加入I相反应体系，体积分别为2.5 mL，以“2.4”项下考察OS转运情况。3 结果3.1 Caco-2细胞的完整性 形态学检查可观察到完整的单层上皮细胞，细胞间连接紧密，细胞具有不对称性，融合成连续的单细胞层。这些细胞与小

15、肠上皮细胞极为相似，实验前后TEER值均为460-500之间，Caco-2 细胞具有良好的完整性，适合于药物转运实验。3.2 分析方法的专属性考察 分别取“2.5.2”和“2.5.6”项下样品，同样方法处理I相反应体系和 HBSS的空白样品，照“2.4”项下进行测定，实验结果表明，空白样品仅含有溶剂峰，“2.5.2”项下样品含有 OS 和 IS 的色谱峰，“2.5.6”项下样品除溶剂峰、OS 和 IS 的色谱峰外，又增加了4个色谱峰（M1, M2, M3, M4），结果见图2。I.S., M1, M2, M3, M4 和 OS 的保留时间分别是 4.7, 7., 7.9, 10.2, 10.7

16、 and 18.9 min，OS、IS 及M1, M2, M3, M4有较好的分离度，没有干扰物质存在，实验结果表明本测定方法具有较好的专属性。图2 A-OS和IS在I相反应体系中色谱图；B-OS和IS在灭活的I相反应体系和Caco-2 细胞模型中色谱图；C-空白I相反应体系中色谱图；D-空白HBSS中色谱图。Fig.2 A-Representative HPLC chromatograms of OS and IS in phase I reaction system ；B-OS and IS in inactivated phase I reaction system and Caco-2

17、 cell model ；C- blank phase I reaction system；D-And blank HBSS。 3.3 标准曲线的线性、最低检测量（LLOD）和最低定量限（LLOQ） 采用加权最小二乘法,以 OS 与内标的峰面积比对 OS 浓度作标准曲线。结果 OS 在 0.47 M60 M范围内，OS 在 Caco-2 细胞模型中的回归方程为: y = 0.0332 x - 0.0069 （r= 0.9992），线性关系良好，最低检测量（LLOD）和最低定量限（LLOQ）分别是0.2 M 和0.47 M。3.4 回收率和精密度试验 在HBSS中分别加入高、中、低3种不同浓度的

18、 OS 溶液，使其终浓度为1.5、 30和60 M，照“2.4”项下进行处理测定，结果见表1，从表1中看出，其日内和日间精密度分别不大于4.09%和4.73%。表 1 OS测定的回收率和精密度试验结果（n = 6）Tab. 1 Results of recovery and precision（n = 6）3.5 稳定性试验 在HBSS中加入 OS 溶液, 使其终浓度为15 M, 于37 C孵育箱中放置，分别于0 、4 、8 、12 及24 h ，照“2.4”项下进行处理测定，结果表明样品在72 h内稳定。3.6 不同浓度的OS溶液对OS在Caco-2 细胞模型中转运的影响 研究了5、10及1

19、5 M 三种浓度的OS溶液在Caco-2 细胞的转运，见图3、表2，结果表明，随着OS溶液浓度的增加，AP-BL 的转运量增加，OS 表观通透系数PAP和PBL较高（1010-6），表明 OS 容易被吸收21，22，但3个浓度的PAP和PBL比值无明显变化，OS的吸收可能是被动吸收。图 3 不同OS浓度溶液对OS在Caco-2 细胞转运的影响（n = 3）.Fig.3 Effects of different concentrations on transport of OS across Caco-2 cell monolayer（n = 3）.表2 不同OS浓度溶液的OS表观通透系数（n

20、= 3）Table 2. Papp of OS of deference concentrations of OS solution across Caco-2 cell model （n = 3）3.7 PEG600对OS在Caco-2 细胞模型中转运的影响 将0.5%PEG600 15 M OS的溶液加入 AP 侧， BL 侧加入 HBSS 考察 OS 在 Caco-2 细胞模型中转运情况，结果表明，含0.5%PEG600 15 M OS溶液 AP-BL 的转运量和15 M OS 溶液比较明显增加，可能 PEG600是一个表面活性剂，可以使Caco-2 细胞的表面张力降低，从而使 OS 在

21、 Caco-2 细胞中的转运速度增加，结果见图4。图 4 PEG600对OS在Caco-2 cell 转运的影响（n = 3）Fig 4 Effect of PEG600 on transport of OS across Caco-2 cell monolayer（n = 3）3.8 P-gp 抑制剂 verapamil 对 OS 在 Caco-2 细胞模型中转运的影响 通过考察 HBSS 配制成含10 M verapamil 的15 M OS 溶液在 Caco-2 细胞模型中转运情况，结果表明，加入 P-gp抑制剂 verapamil 后，与不加 P-gp 抑制剂 verapamil 的1

22、5 M OS 溶液相比，在Caco-2 细胞表观通透系数 PAP 和 PBL 无显著差异，见图5。图 5 P-gp 抑制剂verapamil对OS在Caco-2 细胞转运的影响（n = 3）Fig 5 Effect of P-gp inhibitors of verapamil on transport of OS across Caco-2 cell monolayer（n = 3）3.9 不同浓度的OS溶液对OS在Caco-2 细胞模型中转运速度的影响 比较不同浓度的 OS 溶液的OS 平均透过 Caco-2 细胞的转运速度，结果见图6。图 6 各种溶液OS透过Caco-2 细胞的转运速度

23、（n = 3）Fig 6 Rate of transport of OS of difference solution across Caco-2 cell monolayer（n = 3）试验结果表明，随着 OS 溶液浓度的增加，OS 透过 Caco-2 细胞的转运速度增加，含0.5% PEG600 15 M OS 溶液转运速度与其他溶液相比有显著性差异（P 10-6），表明 OS 容易被吸收21，22，但3个浓度的 PAP 和 PBL 比值无明显变化，说明 OS 的吸收可能是被动吸收。P-gp 是一个由多药耐药基因编码的跨膜糖蛋白，为能量依赖性药物外排泵，在体内广泛分布，对药物体内的吸收、

24、分布、代谢和排泄有重要的影响， 特别是对 P-gp 底物口服生物利用度的影响。Verapamil 是常见的第一代 P-gp 抑制剂19，20，本实验结果表明, verapamil 对 OS 在 Caco-2 细胞中的表观通透系数 PAP 和 PBL 无显著影响，说明 OS 在 Caco-2 细胞中的吸收转运机制主要是被动扩散。随着温度的增加，OS 的转运量增加，但活化能较低（4.14 Kcal/mole），说明 OS 的吸收机制可能是被动的23。OS 在 Caco-2 细胞模型的转运实验表明，OS 容易被吸收，但当 Caco-2 细胞模型 BL 侧含有I相反应体系时，OS 从 AP 侧转运到

25、BL 侧后被较快的代谢并检测到多个代谢产物，后者的快速代谢可能影响 OS 的生物利用度；文献报道 13 分别给予家兔 OS 胶囊和-环糊精包合物 OS胶囊，前者较后者的生物利用度低，有显著性差异（P 0. 05），这可能是由于 OS 被-环糊精包合后提高了 OS 的吸收量，从而提高了 OS 的生物利用度。5 参考文献1 Zhang,Xy, Xiang,Rd.Research of chemical components of cnidium monnieri （L.）cussonJ.Chinese traditional and herbal drugs,1997,28（10）:588-590

26、.2 ChP.（2005）Vol IJ.2005:367-368.3 Fujioka T, Furumi K, Fujii H, et al .Antiproliferative constituents from umbelliferae plants. New furanocoumarin and falcarindiol furanocoumarin ethers from the root of angelica japonica J. Chem. Pharm. Bull, 1999, 47（1）: 96-100. 4 Cheng,ZJ Xu,WX,Yong-hua,et al.Inhibition of Osthol on Adenocarcinoma and Squamacarcinoma of lung J. Carcinogenesis,teratogenesis and mu