色谱理论_精品文档资料下载.pdf
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parameters重要的术语和参数Separationvolumes分离体积Resolution分辨率Selectivity选择性Efficiency柱效Symmetry对称性Linearflowrate线性流速Capacity载量Separationvolumes分离体积voidvolumeVovolumeofthegelmatrixVsporevolumeViVVooVVRRVVttVVccVo=voidvolume外水体积VR=retentionvolumeorelutionvolume保留体积/洗脱体积Vt=totalliquidvolumeofthebed总液体体积Vi=innerporevolume=Vc-VsVo内孔体积/内水体积Vc=totalgeometricvolumeofthecolumn柱体积Vs=volumeofgelmatrix固相凝胶的体积Resolution分辨率（分离峰的能力）thepowertoseparatepeaks1020ml0200400ml0Remember:
wearenotpurifyingpeaks,butproteins&
peptides!
注意：
我们不是在纯化峰，而是纯化蛋白质和多肽！
Maximumnumberofpeaksingelfiltrationca15MaximumnumberofpeaksinRPC150Resolutionfactor,Rs分辨率Rs=4Rs=0.6Rs=1V2-V1（W1+W2）/2Rs=两峰相对于其峰宽而言,分开的有多远Resolution:
dependson分辨率取决于selectivity选择性andefficiency柱效highefficiencylowefficiencyEfficiency柱效:
峰宽的量度柱效越高峰越窄高柱效需要良好的柱填装技术高柱效有时可弥补选择性不足Selectivity选择性:
峰分离的量度高选择性可以达到基线分离高选择性可以弥补低的柱效-峰体积有可能增加lowerselectivityhighselectivitySelectivity选择性Tomaximizethedifferencesbetweenproteins!
使得不同蛋白之间的差异最大化!
取决于Separationtechnologies分离技术Chromatographymediascreen填料筛选Separationconditionsscreen参数优化Efficiency柱效ApowerfultooltoimproveResolution!
提高分辨率的有力工具！
取决于flowrateflowrate流速particlesizeofmatrix粒径大小particlesizedistributionofmatrix粒径分布packingqualityofthecolumn层析柱的装填samplevolumeandviscosity样品体积和黏度增加流速Bandbroadeningeffects峰展宽的影响因素DiffusionalongcolumnMasstransfer（传质阻力）降低流速小分子流速大分子峰宽流速峰宽大粒径/大分子小粒径/小分子流速峰宽装填不均一填料性状不规则装填良好均一的球形颗粒Eddydiffusion（涡流扩散）均一的填料良好填装（轴向扩散）Eddydiffusion（涡流扩散）Particlesdistribution&
packing填料粒径分布&
柱装填质量流速（Flow）对峰宽（Peakwidth）的影响峰宽峰宽（HETP）流速流速（ml/min）ml/min）eddydiffusioneddydiffusiondiffusiondiffusionalongcolumnalongcolumnmasstransfermasstransferDiffusionalongcolumn（轴向扩散）:
小分子扩散速度快，高流速下峰较窄Masstransfer（传质阻力）:
小分子传质速度快，低流速下峰较窄Eddydiffusion（涡流扩散）:
装填良好，均一的球形颗粒使峰较窄H=Adp+B/u+Cdp2uH:
等板高度,dp:
粒径,u:
linearflow线速度Adp:
eddy,B/u:
diffusionalongcolumn,Cdp2u:
masstransfer（层析速率方程）Efficiency柱效测定方法W1/2h=半峰高处峰宽VrAU280V）N=5.54（W1/2hr2N理论塔板数；
L柱高Test:
1%丙酮溶液大约0.5%的柱体积，0.2AUFS在280nm或者用2MNaCl用电导检测建议在检查柱效和寿命时检测HETP=L/NSymmetry:
对称性theshapeofyourpeak峰的形状As=1isperfectshapedGausscurveAs1peakistailing拖尾As1peakisleading前倾widthsat10%heightVrAU280baAs=baAS0.81.5一般可以接受！
线性流速（linearflowrate）体积流速（ml/min）x60截面积（cm）2线性流速线性流速（cm/hr）=体积流速（ml/min）柱高（cm）线性速度线性速度：
流体前沿沿柱管向下的迁移速度（cm/hr）Capacity载量（Adsorptionchromatography吸附层析）FlowFlow流速流速MasstransferMasstransfer传质阻力传质阻力Beadssurface&
innerporesBeadssurface&
innerpores填料表面和内孔填料表面和内孔BulkBulk溶液主体溶液主体Capacitydependson载量取决于:
-Proteinproperties蛋白性质-MW分子量,shape形状,charge电荷,hydrophobicity疏水性,etc-Mediaproperties填料性质-开孔率,粒径,配基密度,etc-Operationparameters操作条件-pH,saltconc.盐浓度,additives添加剂,proteinconc.蛋白浓度,temp温度,flow流速Capacity载量（mgprotein/mlbeads）-Staticcapacity静态载量-Shake&
Incubate混合&
孵育-Dynamiccapacity动态载量（DBC）:
质量传递-Flow,residencetime（停留时间）calculation体积流速（ml/min）x60截面积（cm）2线性流速（cm/h）=体积流速（ml/min）柱高（cm）柱高（cm）x60线性流速（cm/hr）停留时间停留时间Tr（min）=DynamicCapacity（mgprotein/mlbeads）动态载量-Residencetime停留时间（bedheight柱高,linearflow线性流速）-真实样品（proteinconc.蛋白浓度,buffer缓冲液,impurities杂质成分,temp温度）-Goodcolumnefficiency好的柱效Co/Cimg/mlbeads穿透曲线穿透曲线30609010.510%BT300cm/hrFeedsample料液CoutCinQ&
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