分子标记的实验原理及操作流程精Word文档下载推荐.docx

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三、实验试剂

1.试剂:

请使用高质量产品,推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品。

DNA提取试剂盒;

EcoRI酶,MseI酶,T4连接酶试剂盒;

Taq酶,dNTP,PCRreactionbuffer;

琼脂糖电泳试剂:

琼脂糖,无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;

超纯水（18.2MΩ·

cm

2.其他实验需要物品

微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。

四、实验流程

1、总DNA提取

使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。

一般来说,100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。

2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品

EcoR11ul

10×

Buffer2ul37℃65℃30min终止反应sample（总DNA5ul

ddH2O12ul

3、Mse1酶消化（20ul体系/样品

Mse12ul（1U/ul

Buffer2ul

sample（EcoR1酶切产物80℃30min终止反应ddH2O1ul

4、T4DNALigase（20ul体系/样品

T4DNALigase2ul（1U/ul

sample（双酶切产物10ul

Mse1Adaptor1ul2265℃10min终止反应EcoR1Adaptor1ul

ddH2O4ul

5、预扩增（20ul体系/样品

sample4ul

Primer（Mse1/EcoR11ul

AFLPCoreMix15ul

*AFLPCoreMix配方:

ddH2O13.8ul

MgCl21.6ul

dNTPs（2.5mM1.6ul

Taq酶（1U/ul1ul

预扩增程序:

94℃2min

94℃

56℃

72℃2min

60℃30min

6、选择性扩增（20ul体系/样品

sample4ul（预扩增产物稀释20倍Primer（Mse1-XXX/EcoR1-XXX1ul

选择性扩增程序:

94℃20s

66℃30s每循环降1℃,共10个循环72℃2min

56℃30s20个循环

7、产物电泳检测

上样液:

LoadingBuffer20ul

Sizestandard-6000.2ul

Sample3ul（稀释10倍

四、实验结果与分析

本实验使用贝克曼库尔特（BeckmanCoulter公司CEQ8000遗传分析系统,运用先进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验,扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离,采用激光激发荧光采集数据,灵敏度极高,电泳结果通过软件自动统计分析并转换成“0、1”矩阵,便于对结果进一步深入分析研究,整个电泳、数据采集和数据分析过程由软件来控制完成,最大程度避免了人工操作造成的误差,提高了数据的可靠性。

产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行（图1,得到的数据（图2

用第三方软件再进一步统计分析。

图1AFLP分子指纹图谱

图2AFLP“0、1”矩阵图AFLP操作流程图:

酶切

Mse1酶切

优化数据分析

附录1:

常用的8对AFLP选择性扩增引物:

E-AGG:

5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3

E-ACG:

5-GACTGCGTACCAATTCACG-3

E-AAC:

5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3

E-ACA:

5-GACTGCGTACCAATTCACA-3

E-AGC:

5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3

E-ACT:

5-GACTGCGTACCAATTCACT-3

E-AAG:

5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3

Tel:

+8653280998002Fax:

+8653280998005网站:

地址:

山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706

E-ACC:

5-GACTGCGTACCAATTCACC-3

M-CAA:

5-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3M-CAC:

5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3M-CAG:

5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3M-CTA:

5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3M-CAT:

5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3M-CTC:

5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3M-CTG:

5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3M-CTT:

5-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3

附录2:

AFLP传统垂直板电泳（银染法检测介绍:

原理与方法同前,区别:

1.选择性扩增引物不带荧光标记;

2.电泳方法不同,采用测序胶垂直板电泳;

3.电泳结果采用银染法,比较直观,但条带的统计与分析全人工化,工作量大,银染法灵敏度比荧光标记法要低。

示例:

下图为玉米（maizeDNA的AFLP图谱。

PanelA:

AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingEcoR1primerE-AGGwitheightMse1primers:

M-CAA（1,M-CAC（2,M-CAG（3,M-CAT（4,M-CTA（5,M-CTC（6,M-CTG（7,andM-CTT（8.

PanelB:

AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingMse1primerM-CAGwitheightEcoR1primers:

E-AAC（a,E-AAG（b,E-ACA（c,E-ACT（d,E-ACC（e,E-ACG（f,E-AGC（g,andE-AGG（h.

地址:

二ISSR分子标记的实验原理及操作流程

ISSR（inter-simplesequencerepeat标记是一种类似RAPD,但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。

其原理具体是,ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点,利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物,无需预先克隆和测序。

用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列,由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。

一、实验材料

不同来源的DNA（30-50ng/ul。

二、实验设备

PCR仪,PCR管或硅化的0.5mleppendorf管,电泳装置,凝胶成像仪。

三、试剂

1、ISSR引物:

购买成品或根据加拿大BritishColumbia大学设计的ISSR引物序列（见附录自己合成。

2、Taq酶

3、10xPCR缓冲液

4、MgCl2:

25mmol/L。

5、dNTP:

2.5mmol/L。

四、操作步骤:

1.在25ul反应体系中,加入模板DNA1ul（30-50ngISSR引物1ul（约5pmol10xPCRBuffer2.5ul

MgCl22ul

dNTP2ul

Taq酶1单位（U

加ddH2O至25ul

混匀稍离心,加一滴（约20ul矿物油。

2.在PCR仪中预变性94℃2分钟,然后循环:

94℃1分钟,45℃-68℃40秒,72℃1-2分钟,共40轮循环。

3.循环结束后,72℃10分钟,4℃保存。

4.取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液（6x于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100V（电压低带型整齐,分辨率高。

5.电泳结束,溴化乙锭染色20分钟。

6.用凝胶成像仪观察、拍照。

操作流程简图:

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注:

样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法

DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法

附录UBCPrimerSet#9（Microsatellite

引物名称

序列

引物名称序列

801ATATATATATATATATT851GT