分子标记的实验原理及操作流程精Word文档下载推荐.docx

1、三、 实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊 TOYOBO 公司的相关产品。DNA 提取试剂盒;EcoRI 酶,MseI 酶,T4连接酶试剂盒;Taq 酶,dNTP, PCR reaction buffer;琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒 GeneFinder 核酸染料替代传统 EB 染料; 超纯水（18.2M cm2.其他实验需要物品微量移液枪（一套及相应尺寸 Tip 头,PCR 管,冰浴等。四、 实验流程1、 总 DNA 提取使用 DNA 提取试剂盒提取植物基因组 DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑 胶检测。一般来说, 100ng 的基因组 DNA 作为反应模板是足够的

2、。2、 EcoR1酶消化 （20ul 体系 /样品EcoR1 1ul10Buffer 2ul 37 65 30min终止反应 sample（总 DNA 5ulddH 2O 12ul3、 Mse1酶消化 （20ul 体系 /样品Mse1 2ul （1U/ulBuffer 2ulsample（EcoR1酶切产物 80 30min终止反应 ddH 2O 1ul4、 T4 DNA Ligase（20ul 体系 /样品T4 DNA Ligase 2ul（1U/ulsample（双酶切产物 10ulMse1 Adaptor 1ul 2265 10min终止反应 EcoR1 Adaptor 1ulddH 2

3、O 4ul5、 预扩增 （20ul 体系 /样品sample 4ulPrimer（Mse1/EcoR1 1ulAFLP Core Mix 15ul* AFLP Core Mix 配方:ddH 2O 13.8ulMgCl 2 1.6uldNTPs（2.5mM 1.6ulTaq 酶 （1U/ul 1ul预扩增程序:94 2min945672 2min60 30min6、选择性扩增 （20ul 体系 /样品sample 4ul（预扩增产物稀释 20倍 Primer（Mse1-XXX/EcoR1-XXX 1ul选择性扩增程序:94 20s66 30s 每循环降 1,共 10个循环 72 2min56

4、30s 20个循环7、产物电泳检测上样液:Loading Buffer 20ulSize standard-600 0.2ulSample 3ul（稀释 10倍 四、实验结果与分析本实验使用贝克曼库尔特 （BeckmanCoulter 公司 CEQ8000遗传分析系统, 运用先 进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验, 扩增产物在高分辨率毛细管中电泳 分离,采用激光激发荧光采集数据,灵敏度极高,电泳结果通过软件自动统计分析并转 换成“ 0、 1”矩阵,便于对结果进一步深入分析研究,整个电泳、数据采集和数据分析 过程由软件来控制完成,最大程度避免了人工操作造成的误差,提高了数据的可靠性。

5、产物电泳数据采集在 CEQ8000遗传分析系统上进行（图 1 ,得到的数据（图 2用第三方软件再进一步统计分析。图 1 AFLP分子指纹图谱图 2 AFLP“ 0、 1”矩阵图 AFLP 操作流程图:酶切Mse1酶切优化 数据分析附录 1:常用的 8对 AFLP 选择性扩增引物:E-AGG: 5-GACTGCGTACCAATTCAGG -3E-ACG: 5-GACTGCGTACCAATTCACG -3E-AAC: 5-GACTGCGTACCAATTCAAC -3E-ACA: 5-GACTGCGTACCAATTCACA -3E-AGC: 5-GACTGCGTACCAATTCAGC -3E-ACT

6、: 5-GACTGCGTACCAATTCACT -3E-AAG: 5-GACTGCGTACCAATTCAAG -3Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706E-ACC: 5-GACTGCGTACCAATTCACC -3M-CAA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAA -3 M-CAC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAC -3 M-CAG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAG -3 M-CTA: 5-GAT GAG TCC T

7、GA GTA A CTA -3 M-CAT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAT -3 M-CTC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTC -3 M-CTG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTG -3 M-CTT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTT -3附录 2:AFLP 传统垂直板电泳 （银染法检测 介绍:原理与方法同前,区别:1. 选择性扩增引物不带荧光标记; 2. 电泳方法不同,采用测序 胶垂直板电泳; 3. 电泳结果采用银染法,比较直观,但条带的统计与分析全人工化,工作量 大,银染法灵敏度比荧光标记法要低。

8、示例:下图为玉米（maizeDNA的 AFLP 图谱。Panel A: AFLP fingerprints of control maize DNA using EcoR1 primer E-AGG with eight Mse1 primers: M-CAA （1, M-CAC （2, M-CAG （3, M-CAT （4, M-CTA （5, M-CTC （6, M-CTG （7, and M-CTT （8.Panel B: AFLP fingerprints of control maize DNA using Mse1 primer M-CAG with eight EcoR1 pri

9、mers: E-AAC （a, E-AAG （b, E-ACA （c, E-ACT （d, E-ACC （e, E-ACG （f, E-AGC （g, and E-AGG （h.地址:二 ISSR分子标记的实验原理及操作流程ISSR（inter-simple sequence repeat标记是一种类似 RAPD,但利用包含重复序列 并在 3 或 5 锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用 SSR 引物来扩增重 复序列之间的区域。其原理具体是,ISSR 标记根据生物广泛存在 SSR 的特点,利用在生物 基因组常出现的 SSR 本身设计引物,无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为

10、 16-18个碱基序列, 由 1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成, 从而保证了引物 与基因组 DNA 中 SSR 的 5 或 3 末端结合,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的 基因组节段进行 PCR 扩增。一、实验材料不同来源的 DNA（30-50ng/ul。二、实验设备PCR 仪, PCR 管或硅化的 0.5ml eppendorf管,电泳装置,凝胶成像仪。三、试剂1、 ISSR 引物:购买成品或根据加拿大 British Columbia大学设计的 ISSR 引物序列（见 附录自己合成。 2、 Taq 酶3、 10xPCR 缓冲液4、 MgCl 2:25mmol/

11、L。 5、 dNTP :2.5mmol/L。四、操作步骤:1. 在 25ul 反应体系中,加入 模板 DNA 1ul （30-50ng ISSR 引物 1ul （约 5pmol 10xPCR Buffer 2.5ulMgCl 2 2uldNTP 2ulTaq 酶 1单位（U 加 ddH2O 至 25ul混匀稍离心 , 加一滴（约 20 ul矿物油。2. 在 PCR 仪中预变性 94 2分钟 , 然后循环 : 94 1分钟, 45 -68 40秒, 72 1-2分钟,共 40轮循环。3. 循环结束后 , 72 10分钟, 4保存。4. 取 PCR 产物 15ul 加 3ul 上样缓冲液 （6x于 1.6% 或 1.8% 琼脂糖胶上电泳 , 稳压 50-100 V（电压低带型整齐, 分辨率高 。5. 电泳结束,溴化乙锭染色 20分钟。6. 用凝胶成像仪观察、拍照。操作流程简图:注:样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等 DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录 UBC Primer Set #9 （Microsatellite引物名称序列引物名称 序列801 ATA TAT ATA TAT ATA TT851 GT