植物组织培养的一些注意事项Word文件下载.docx

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适于花药培养。

②尼奇培养基（Niotsch1969）此培养基与H培养基成分基本相同,仅生物素比H培养基高10倍。

也适合于花药培养。

③米勒培养基（Miller1963）此培养基和Blaydes（1966）培养基二者成分完全相同。

适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用。

4、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基。

有以下几种:

①改良怀特培养基（White1963）

②WS培养基（Wolter&

Skoog1966）

③克诺普液（Knop1965）花卉培养上用得多。

④贝尔什劳特液（Berthelot1934）

⑤HB培养基（Holley&

Baker1963）此培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎尖培养中效果良好。

其成分是大量元素比1/2克诺普（Knop）液稍多,微量元素用贝尔什劳特液,每升培养基中加0.5ml。

二、与培养基有关的一些细节问题

1、培养基所用药品应采用等级较高的化学纯CP（三级）及分极纯AR（二级）,以免杂质对培养物造成不利影响。

2、调节PH也可用精密pH试纸（应在干燥器中保存,以免吸湿而失效）。

培养基过酸的可用1mol/L氢氧化钠（NaOH）来调节;

培养基过碱的可用1mol/L盐酸（HCl）来调节（1mol/LNaOH的配制方法是称40gNaOH,溶解后加入蒸馏水,定容到1000ml即可。

1mol/LHCl的配制方法是量取12mol/LHCl84ml,加水定容至1000ml）。

经高压蒸汽灭菌后,由于某些成分的分解（如蔗糖的分解）或氧化,酸度会增加（pH值一般可降低0.2）。

有时玻璃器皿质量较差,其中一部分物质溶解,也会影响酸度的变化。

这些在调整pH值时都要考虑进去。

分装后应立即灭菌,若因故不能及时灭菌,最好放入冰箱中在24h内完成灭菌工作。

灭菌时压力表读数为0.8kg/cm2～1.1kg/cm2,121℃时保持15min～20min即可。

3、某些生长调节物质,如吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等物质遇热不稳定,因此不能进行高压灭菌,而需用过滤方法灭菌,经过滤灭菌的溶液,可在琼脂培养基温度下降到大约40℃时加入到已高压灭菌的培养基中。

4、配好的培养基可放到培养室中预培养3d,若没有污染反应,则证明是可靠的,可以使用。

暂时不用的培养基最好置于10℃下保存,含有生长调节物质的培养基在4℃～5℃低温下保存则更理想。

含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制一周内用完,其他培养基至多也不能超过一个月。

一般情况下,两周内应用完,以免干

燥变质。

三、培养材料及消毒

1、取材季节的影响：

大多数植物应在其生长开始的季节采样,生长末期或已进入休眠期,则外植体对诱导反应迟钝或无反应。

2、器官的生理状态和发育年龄：

沿植物的主轴,越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短,其生理年龄也越老,越接近发育上的成熟,越易形成花器官。

反之,越向下,其生理年龄越小。

木本植物的组织培养中,以幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条较好,下胚轴与具有3对～4对真叶的嫩茎段,生长效果也较好。

一般情况下,幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力。

3、材料大小的影响：

材料越小成活率越低,茎尖培养存活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1个～2个叶原基,约0.2mm～0.3mm大小。

叶片、花瓣等约为5mm2,茎段则长约0.5mm。

因此,除非用于去除病毒否则不宜将外植体切的过小。

但并不是说外植体越大越好,外植体过大易造成污染,有实验证明外植体越大污染率越高。

4、材料的灭菌：

一般是组织越大越易污染,夏季比冬季带菌多，甚至不同年份污染的情况也有区别。

取材最好选在中午或下午,避开阴雨天取材可减少污染率。

消毒是为了消灭病菌,以保证无菌组织培养的进行。

但不同植物及一株植物不同部位的组织,其带菌程度不同,它们对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样。

最初所使用的消毒剂种类,浓度及消毒时间的长短都要进行摸索,以达到最佳的消毒效果。

材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80,对与难消毒的根及地下部位材料可将其浸入消毒液中进行抽气减压,以帮助消毒液的渗入,从而达到彻底灭菌的目的。

潘学峰等（1998）报道,12%的双氧水+0.1%的升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌10min的效果最好。

四、材料的接种

1、接种室的消毒：

植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术,做好接种室的消毒是至关重要的。

污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子,因此,每次接种前应进行地面的清洁卫生工作,并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降,并用紫外线灯照射20min。

接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,并定期清洗过滤膜,以延长使用寿命。

2、无菌操作要求：

工作人员使用的工作服、帽子、口罩等,要经常保持干净,并定期进行消毒,即将洗净、晾干的衣帽、口罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌。

工作人员的头发、衣服、手指中都带有许多杂菌,为此要穿上工作服,戴上帽子,也必须剪除指甲,并用肥皂擦洗,最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10

min,接种操作前则用70%酒精擦洗。

工作人员的呼吸所产生的污染,主要是

在接种时谈话或咳嗽所引起的,因此,在操作时应禁止谈话并应戴上口罩。

3、材料的分离、切取和接种

切割动作要快,防止挤压使材料受损伤而招致培养失败,也要避免使用生锈的刀片,以防止氧化现象产生。

接种时要防止交叉污染的发生,刀和镊子等接种工具使用一次应放入70%（或95%）酒精中浸泡,然后灼烧放凉备用。

接种时轻轻取下封口纸,动作要慢以免气流冲入瓶中造成污染。

将瓶口靠近酒精灯火焰,瓶口倾斜,以免空气中的微生物落入瓶中,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟,将灰尘杂物等固定在原处,然后用镊子将外植体送入瓶中,材料在培养容器内的分布要均匀,以保证必要的营养面积和光照条件。

茎尖、茎段等基部插入固体培养基中,叶片通常将叶背接触培养基,这是由于叶背气孔多,利于吸收水分和养分的缘故。

五、材料的初代培养

1、实验方案的设计

1）、单因子实验设计：

单因子实验是组织培养中最常用的实验方法,尤其在选择适当的激素种类和浓度配比上使用最多。

2）、正交实验设计植物离体培养的成功是由多种因素决定的。

正交设计是多因素分析的有力工具,它可以很方便的从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平,因为它可以用较少的实验次数得到较多的信息。

例如,一个7因素水平的实验,若将各因素水平全部组合都做一遍,需要27=128次,而正交设计只需做8次实验就可以了,虽然实验次数减少了,但因为各因素水平搭配均匀,8次实验基本代表了全部实验的情况。

正交实验的设计,主要工具是正交表。

大多数生物统计学书都列出了可供选择的正交表,如L4（23）,L8（27）见（表2-11,表2-12）。

字母L右下角号码8表示它有8个实验要做,括号内的指数7表示这张表所安排的实验最多可考察7个因素（也可安排2个～6个,超过7个要选择其他正交表）,底数2表示被考察的因素只要求两个水平。

在进行实验前可根据要测试因素的多少及每种因素所考察的水平,选择适合的正交表,然后按表进行实验。

现举一个例子来说明,设影响某种植物试管苗生长的因素有光照时间、光照强度、pH值、温度、蔗糖浓度、BA浓度、NAA浓度7个因素,每个因素选择两个水平,即,光照时间（10h,14h）、光照强度（1000lx,2000lx）、pH值（5.5,5.8）、温度（20℃,25℃）、BA浓度（0.5,2.0）、NAA浓度（0.5,1.0）、蔗糖浓度（2%,4%）。

现根据因素和水平的多少选择一个适合本实验的正交表,选L8（27）最理想,填表时,因素水平对号入座,见表（2-13）。

第一号实验是光照时间10h/d、光照强度1000lx、pH值5.5、BA浓度2.0、NAA浓度0.5、蔗糖浓度4%,其他实验依次类推。

根据8个实验结果,如出苗数量、苗高、生根数、移栽成活率等,综合考虑,根据需要选取各最适培养条件。

也可通过一定的计算方法（参考统计学书）,算出极差（R）,极差（R）表示每个因素在实验中所起作用的大小,R越大表示该因素的不同水平对实验结果的影响越大,但若没有可计算的指标时,还是选择单因子实验较好。

2、初代培养物的建立

1）、保证无菌

2）、条件合适：

首先,一定要选择好合适的作物种类、品种及培养的部位;

其次,一定要选择合适的培养基,激素及其他添加物;

还要注意掌握适宜的环境条件。

所以在进行一种植物的组织培养之前,应查找该种植物有关方面的资料,根据这种植物过去所采用的培养部位、培养基、培养条件和培养技术等,再决定自己的工作步骤。

3）、操作技术过关

3、污染的防治

1）、植物材料的选择及防止污染

通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多;

老的材料比幼嫩的材料带菌多;

田间生长的材料比温室生长的材料带菌多;

带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多。

为此对于培养材料的取材就应很认真地加以选择,以减少污染的发生。

用茎尖作外植体时,应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。

将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中,使其发枝,然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体,便可大大减少材料的污染。

或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养,待抽出徒长的黄化枝条时取材,也可明显地减少污染。

对木本植物等难以消毒的材料可采用多次灭菌法。

如将切好的外植体放入1.3%次氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%的溶液）消毒30min,然后用无菌水冲洗3次,再放在无菌条件下,次日用2.6%次氯酸钠灭菌30min,然后用无菌水冲洗3次。

也可采用多种药液多次浸泡法,以加强灭菌效果。

材料内部易感染病菌,在这种情况下,必须在培养基中加入抗生素类,防止初代培养物污染。

2）、人为污染的防止

接种前应用肥皂将手仔细洗净后,再用70%酒精擦洗双手,并需及时剪除指甲。

在工作中特别要注意避免交叉感染,双手必须清洁,工具则用一次即需消毒一次