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SRTP结题论word版

SRTP结题论文

论文题目：

骆驼下丘脑组织中褪黑素受体MT1基因的克隆和测序

学院动物医学院

专业动物医学

年级班级08级1班

姓名胡国明

指导教师张勇胡俊杰

摘要1

关键词1

背景及意义1

1实验材料2

1.1仪器与试剂2

1.2采样2

2实验方法2

2.1提取总RNA2

2.2反转录（RT），获得总的CDNA4

2.3设计引物，进行PCR4

2.4用凝胶电泳的方法检测扩增片段5

2.5割胶回收目的序列，连载到载体并测序5

3实验结果与分析7

3.1实验结果7

4讨论7

参考文献8

致谢8

骆驼下丘脑组织中褪黑素受体MT1基因的克隆和测序

胡国明

（甘肃农业大学动物医学院08级甘肃兰州730070）

【摘要】目的：

褪黑素（5-甲氧基-N-乙酰基色胺，MELeationin,MEL）主要是由松果体和视网膜分泌的一种吲哚类激素，广泛存在于多个物种的脑脊髓液和外周血液中，主要分布于动物的下丘脑、肾上腺等多个组织中。

其在生物的昼夜节律，视网膜信号调节及季节性繁殖哺乳动物的生殖调控等方面具有重要的作用。

本实验利用分子生物研究方法研究骆驼脑组织中的褪黑素受体基因，为进一步研究褪黑素对季节性繁殖动物的作用机理体提供基础。

【关键词】：

褪黑素、下丘脑、RT—PCR、褪黑激素受体、松果体、MT1基因

【背景及意义】

褪黑素（melatonin,Mel）是松果体分泌的一种神经内分泌激素，松果体分泌Mel具有昼夜节律，由下丘脑视交叉上核（supra-chiasmaticnucleus,SCN）控制，与自然界的光-暗周期的变化合拍。

这种节律性波动表现为夜间达到高峰而白昼降至谷值，即Mel主要在夜间分泌。

早在1917年，McCord和Allan发现了牛松果体提取物能使蟾蜍皮肤颜色变浅，首次揭示了松果体Mel的生物活性，标志着Mel研究的开始。

1959年，皮肤病学专家Lerner分离纯化并确定了该物质的结构，将其命名为Mel，成为松果体研究史上的重要里程碑，揭开了对松果体Mel研究的序幕。

此后，实验室先后报道了鸟和鼠脑类、胃肠、免疫器官及生殖系统均存在Mel受体。

刘志民、赵瑛教授报告了人胚胎、心、肝、肾等组织及各种脑区存在Mel受体，提示人体各种器官是Mel作用的靶器官，为研究Mel作用年奠定了基础。

1994～1995，Repper等克隆出哺乳动物Mel受体mt1和mt2亚型，标志着Mel研究进入分子生物学阶段。

实践证明，褪黑素在促进母猪性成熟和山羊绒生长和水貂皮的生长、调节公猪的行为等各方面都有良好的效果，但对促进畜禽生长的最佳剂量、供给途径及时间等问题值得深入研究。

考虑到动物在放牧状态下，其营养受季节性影响

较大，而褪黑素可以起到与季节效应相似的调节动物行为的作用。

因此深入研究褪黑素在动物体内的代谢及外源性褪黑素对畜禽生产的影响机理具有深远的理论意义和实际价值

1实验材料

1.1仪器与试剂

超净工作台、超低温冰柜、离心机、离心管、PCR反应管、移液枪、电泳仪、PCR仪、紫外线检测仪、水浴锅

RNAisoPlus、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理水、5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer（50uM）*1、Random6mers（100uM）*1、TotalRNA、RnaseFreedH2O、BufferDE-A、BufferDE-B、BufferW1、BufferW2、Eluent

1.2采样

采取母骆驼的下丘脑组织，用液氮保存。

2实验方法

2.1提取总RNA

①将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。

对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAisoPlus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。

②将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。

③12，000g4℃离心15分钟。

④小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。

⑤向上述匀浆裂解液中加入氯仿（RNAisoPlus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒，（氯仿沸点低，易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。

待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5分钟。

⑥离心机中小心取出离心管，此时离心液分为三层，即：

无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。

吸取上清液转移至另一新的离心管中。

（切忌吸出白色中间层）。

⑦向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。

⑧12，000g4℃离心10分钟.一般在离心后。

试管底部会出现沉淀。

⑨小心弃去上清液，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好的控制RNA中的盐离子含量，应尽量除尽乙醇）。

⑩室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解），加入适量的RNAase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，将RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

●RNA提取操作流程图

适量的动植物组织或培养细胞

↓加入适量的RNAisoPlus后匀浆

室温静置5分钟

↓12，000g4℃离心5分钟，上清转移至新1.5mltube中

加入1/5RNAisoPlus体积量的氯仿

↓振荡混匀

室温静置5分钟

↓12，000g4℃离心15分钟

将上清液转移至新的离心管中

↓加入与上清液等体积的异丙醇

室温静置10分钟

↓12，000g4℃离心10分钟

向沉淀加入1ml的75%乙醇清洗沉淀

↓12，000g4℃离心5分钟

弃上清保留沉淀

↓干燥

溶解于适量的DEPC处理水中

2.2反转录（RT），获得总的CDNA

①TotalRNA0.5-1ug

Oligo（dT）18primer1ul

DEPCtreatedwaterto12ul

②65℃for5min

③在上述样品中依次加入以下试剂

5×ReactionBuffer4ul

RibolockTMRnaselnhibitor（20u/ul）1ul

10mMDntpMix2ul

RevertAidTMM-MuLVReverseTranscriptase（200u/ul）1ul

Totalvolume20ul

④混匀并离心，然后先在42℃放置60分钟，再在70℃放置5分钟。

2.3设计引物

GeneName

Sequence

Length

（mer）

GeneLength

（bp）

LT1

-F

5’-TATGGATGCTGACGCTCGTG-3’

20

452

-R

5’-CGATAGGAAGAAGGAAGTGGAAAA-3’

21

Position

（mRNA）

Tm

（℃）

GC%

ProductLength

（bp）

75

63.33

55.00

150

224

62.00

41.67

TATGGATGCTGACGCTCGTGGCGGTCCTGCCCAACGTGTGCGTGGGGACCCTGCAGTACGACCCGAGGGTCTACTCCTGC

ACGTTCACGCAGTCCGTCAGCTCGGCGTACACGATCACCGTGGTGGTTTTCCACTTCCTTCTTCCTATCG

进行PCR

（50ul反应体系）

组成成分

50ul体系

终浓度

2×MasterMix

25ul

1×

上游Primer（10uM）

2-5ul

400-800nM

下游Primer（10uM）

2-5ul

400-800nM

模板

Pg-ng

total

至50ul

建议PCR反应条件

循环数

温度

时间

说明

1

95℃

2-5min

起始模板变性

95℃

30-45sec

模板变性

30-35

自定

30-45sec

退火

72℃

1min/1-2kb

延伸

1

72℃

10min

延伸

2.4用凝胶电泳的方法检测扩增片段

1.琼脂糖凝胶制备

2.将PCR反应产物与缓冲液和燃料混匀后，加至琼脂糖凝胶样品

孔中，同时设置标准DNA分子量对照。

3.以60—90V电压进行稳压电泳，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端2cm～3cm时停止。

4.将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外光透射仪上观察，与标准DNA分子量及阳性对照比较，分析结果，或用凝胶成像系统拍照保存。

2.5割胶回收目的序列，连载到载体并测序。

割胶步骤如下

①在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。

计算凝胶重量（提前记录1.5ml离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μl体积）。

②加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75°C加热（低熔点琼脂糖凝胶于40°C加热），间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全熔化（约6-8min）。

*BufferDE-A为红色溶液。

在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。

③加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀。

当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。

*加BufferDE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。

④吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g离心1min。

弃滤液。

⑤将制备管置回2ml离心管，加500μlBufferW1，12,000×g离心30s，弃滤液。

⑥将制备管置回2ml离心管，加700μlBufferW2，12,000×g离心30s，弃滤液。

以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次，12,000×g离心1min。

*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

*两次使用BufferW2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。

⑦将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。

⑧将制备管置于洁净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备膜中央加25-30μlEluent或去离子水，室温静置1min。

12,000×g离心1min洗脱DNA。

*将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率

●流程图

含有目的DNA凝胶

计算凝胶体积↓

3实验结果与分析

3.1实验结果

用三个温度扩增，分别是55℃,57.8℃,62℃

55℃,57.8℃可扩增，62℃不清晰

4讨论

褪黑素（melatonin,MT）是松果腺分泌的神经内分泌激素，其分泌呈昼夜

节律。

近年发现，MT生物学作用十分广泛，有镇静、催眠、抗衰老、免疫兴奋、调节内分泌功能等，这些作用可能是通过抗氧化作用来实现的。

本实验通过对骆驼下丘脑组织中的褪黑素受体MT1基因的克隆和测序，为进一步研究褪黑素对季节性繁殖动物的