免疫组化的原理和步骤Word文档格式.docx
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这种方法敏感性更高,有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因:
指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。
产生的原因有以下几个方面:
1、抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子,它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。
任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子,必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2、共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3、决定簇相似,两种不同的抗原决定簇,如果结构大致相同,由于空间构象关系,某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。
当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
免疫细胞化学技术
一、免疫细胞化学技术的概述
*免疫细胞化学（immunocytochemistry,ICC）
-就是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定细胞内抗原的成分（主要就是多肽与蛋白质）,对其进行定位、定性及定量的研究,称为～。
（一）对抗原与抗体的要求
*具有特异性高与亲与力强的抗体就是实验成功的首要条件。
-对抗体的要求:
纯度高、比活性强;
*高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度。
-对抗原的要求:
纯度高,免疫原性强,稳定无变化。
（二）抗原（antigen,Ag）
*抗原的概念:
凡就是在机体内引起体液免疫与（或）细胞免疫反应的物质,称为抗原。
抗原具有两个方面的特性:
-免疫原性:
引起机体产生抗体与（或）致敏淋细胞的特性;
-免疫反应性:
抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
*根据抗原就是否显示免疫原性分为:
-完全抗原:
分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。
*免疫原性最强的就是蛋白质抗原,多糖次之;
脂类与核酸必需与蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原:
又称为不完全抗原,分子量较小。
例如:
某些短肽、多糖、类脂与药物等。
*半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。
载体:
通常就是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白（keyholelimpethemocyanin,KLH）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体（antibody,Ab）
1、抗体的概念:
*机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。
-抗体主要存在于血清内;
-抗体都就是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都就是抗体。
-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体:
单克隆抗体与多克隆抗体。
*单克隆抗体:
就是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,就是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
-特异性强、抗体产量高。
*多克隆抗体:
就是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
-特异性低,会产生抗体的交叉反应。
-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,就是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
*动物的选择
*佐剂（adjuvant）
*免疫方法
*免疫剂量
*抗体效价的测定
*放血或定期抽血
（1）动物的选择
选择什么动物来免疫取决于:
*所需抗血清的量
-小鼠只能提供1、0～1、5ml的血液,而山羊能提供几升。
*能供免疫用的抗原量
-小鼠50μg足够,而山羊需要几毫克。
（1）动物的选择（续）
*动物的品系:
免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
-常用的动物有兔、羊、马、猪等,以兔（新西兰兔,年轻,健壮,体重在2.5kg左右,雄性）为最常用。
（2）佐剂（adjuvant）
*一般可溶性抗原注射后,迅速从注射部位扩散、吸收代谢。
佐剂可延长潴留时间,且延长免疫刺激作用。
因此在制备抗体的过程中,常将抗原与佐剂一起注射。
*最常用的佐剂就是弗氏佐剂,又分为:
-弗氏不完全佐剂（Freund'
sincompleteadjuvant）
-弗氏完全佐剂（Freund'
scompleteadjuvant）
弗氏不完全佐剂
（Freund'
sincompleteadjuvant,FIA）
*就是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80）混合而成,比例为1:
1、2:
1、3:
1或5:
1,可根据需要而定,通常2:
1。
*使用时与水溶性抗原按1:
1比例充分混合,使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂（Freund'
scompleteadjuvant,FCA）
*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为2～20mg/ml）,即成为FCA。
*免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积1:
1混合乳化后（油包水）注入动物。
-一般首次注射时用完全佐剂乳化,第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
*研磨法:
适于制备大量的佐剂抗原
-先将不完全佐剂加热,取1、73ml放人无菌玻璃研钵内;
缓缓滴入0、23ml活卡介苗,边滴边按同一方向研磨,使菌体完全分散。
-按同样方法滴人抗原,每加一滴应研磨至小滴消失。
滴加抗原的速度要慢,待抗原全部加人后,应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
*缺点:
研钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大,对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法（续）
*注射器混合法
-将等量的完全佐剂与抗原分别吸人两个5ml注射器内,然后插入三通管内,交替推动针管混匀,往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
*优点:
无菌操作,节省抗原或佐剂。
不易乳化,时间长。
*快速乳化法:
利用超声波粉碎器可快速乳化抗原与佐剂混合物。
-将抗原与佐剂按所需量加入一中,置于超声波粉碎器上,粉碎头浸入液面下0.5cm,离瓶底0.5cm左右,以免打碎。
-每次乳化10～15s,然后置冰箱lmin左右。
反复乳化3～4次即可完全乳化。
管内残余量800r/min离心5～10min收集。
简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
*判断乳化就是否充分,可将一滴乳化好的液体滴在水面上（冷水中）,如能长时间保持圆珠形而不散开,表示乳化达到要求。
（3）免疫方法——免疫途径
*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
*一般采用多点注射方法
-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
-皮内易引起细胞免疫反应,有利于提高抗体的效价。
（3）免疫方法——免疫途径（续）
*几点说明:
-大动物一般不用腹腔注射
-颗粒抗原与使用佐剂时不能静脉注射
-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法,只需10～100μg抗原即可获得较好的免疫效果。
-皮内注射较困难,特别就是天冷时更难注入。
（3）免疫方法——次数及间隔时间
*次数一般为2～3次（初次免疫与加强免疫）
-首次注射后,10～15天再加强注射;
-剂量同首次或为首次的一半,用不全佐剂或不用佐剂。
*间隔时间,一般而言,动物越大,间隔越长
-豚鼠、大鼠为7～8天,兔子为10～15天,羊为14～28天;
-第三次注射的间隔时间更长些,效果更好。
举例1:
家兔的免疫
*初次免疫
-用50～200μgAg加入FCA,在背部皮下注射6～8点,每点0、1～0、2ml,也可肌肉内或皮内注射;
*两周后,加强免疫
-将50～200μgAg于PBS或FIA中,在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射;
*抗体效价的检测:
加强免疫一周后,耳缘静脉采血
-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。
前者抗体效价在1:
4000以上,后者在1:
16以上,即可采血,取血清进一步提纯。
举例2:
微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
*一般选择2、5～3.0kg的新西兰种公兔
-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0、2ml（卡介苗每兔合5mg）;
-10天后,见胭窝淋巴结肿大,然后将抗原注射至肿大的淋巴结内,第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化;
-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原,以同样方法加强2次,各次注射的抗原均为25～50μg;
-末次注射两周后兔耳放血测价（可达1:
128）。
举例3:
豚鼠与大鼠的免疫
-用10～100μgAg加入FCA,在背部皮内注射4～6点,每点0、lml,也可肌肉内或皮下注射;
*加强免疫
-每隔7～8天,将10～50μgAg于PBS或FIA中。
在肌肉、皮下或静脉注射;
*抗体效价的检测
（4）免疫剂量
*抗原性强的抗原量应小,过大反会引起免疫抑制;
*免疫周期长的动物可少量多次注射,短的可大量少次。
（4）免疫剂量（续）
*各种动物首次免疫抗原剂量与加强免疫的剂量
（5）抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
*指抗原与抗体在同一凝胶内都扩散,彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
-将抗原与抗体分
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