微生物学实验指导书Word文档下载推荐.docx

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三、实验材料：

土壤：

1克充分碾碎的肥沃的花园土样本，放入装有99毫升无菌水的烧瓶中，标记为瓶1:

1:

100稀释度（10¯

²

）。

培养基：

每个实验组：

1瓶75毫升保持在45℃熔化的营养琼脂培养基；

1瓶75毫升45℃甘油醇母琼脂培养基；

1瓶75毫升45℃Sabouraud琼脂培养基。

2瓶99毫升无菌水。

器材：

酒精灯，计数器，无菌1毫升吸管，无菌培养皿，记号笔。

四、实验步骤：

1．按下法标记每组的四个培养基

营养琼脂培养基：

10

，10

（用于细菌计数）。

甘油醇母琼脂培养基：

（用于放线菌计数）。

Sabouraud琼脂培养基：

（用于真菌计数）。

2.用笔标记二瓶99毫升无菌水为瓶2和瓶3。

3.用力摇动1：

100（10

）稀释度的土壤样本大约30分钟。

4.用一支无菌1毫升吸管，从瓶1中吸取1毫升所给土壤样本稀释液到瓶2，并如前用力摇动。

其稀释度为1：

10000（10

5.用另一支无菌1毫升吸管，从瓶2中吸取1毫升稀释液到瓶3，并如前用力摇动。

1000000（10

6.按下法，用无菌1毫升吸管及无菌技术，吸取适当量的每种稀释液到相应标记的平皿中以得到最终所需稀释度。

a.真菌——放入标记的Sabouraud琼脂平皿中

1毫升瓶1稀释液加入到标记10

平皿中

0.1毫升瓶1稀释液加入到标记10

1毫升瓶2释液加入到标记10

0.1毫升瓶2释液加入到标记10

b.放线菌——放入标记的甘油醇母琼脂平皿中

1毫升瓶3液加入到标记10

c.细菌——放入标记的营养琼脂平皿中

0.1毫升瓶3液加入到标记10

平皿中。

7.从水浴中取出熔化的营养琼脂培养基并擦干烧瓶。

用无菌技术，在每个用于细菌计数的平板中倒入大约15毫升培养基，轻轻旋转每个平板以保证培养基中细胞均一分布。

8.重复步骤7，用熔化的Sabouraud琼脂培养基进行真菌计数；

用熔化的甘油醇母琼脂培养基进行放线菌的计数。

9.使所有的琼脂平板固化。

10.把平板置于25℃下，倒置3-7天。

实验二抗生素产生菌的分离

1.用致密平板技术分离抗生素产生微生物

2.确定分离的抗生素抗菌活性范围

土壤是能产生抑制其他微生物生长的抗生素的微生物的主要栖息地。

医学上用的抗生素是从四个土壤微生物种群中分离出来的：

链霉菌，芽孢杆菌，青霉菌和头孢霉菌，它们分别代表着放线菌，细菌和霉菌三个微生物类型。

虽然在工业实验室中不断进行来自全球土壤的筛选以分离得到新的产生抗生素的微生物，但是工业微生物学已把其力量对准已有抗生物质的化学修饰上。

这是通过增加或取代化学侧链、重组分子内键，或产生能分泌更多潜在形式抗生素的突变体微生物菌株来完成的。

化学同类物的产生是为了防止抗生素抗性的产生，把对宿主不利的副作用降到最小和增加抗生素的有效范围。

实验的A部分中，学生将使用致密平板技术从土壤样品中分离抗生素产生微生物，其中之一接种灰色链霉菌作为阳性对照。

在B部分中，显示抗生素活性的分离物将被筛选出来对几种不同的微生物进行抗性反应以确定它们的效果。

培养物：

B部分，用trypticasesoy肉汤培养基培养24小时的大肠杆菌，金黄色葡萄球蓖，耻垢分枝杆菌和铜绿色假单胞菌。

土壤悬液：

A部分，1：

500稀释度的土壤悬液（每50毫升自来水0.1克土样）作为未知；

1：

500稀释度土壤接种链霉菌作为阳性对照。

A部分，500毫升烧杯，试管，无菌平皿，接种针，加热板，温度计，1毫升和5毫升吸管，放大镜。

B部分，酒精灯和接种环。

A部分抗生素产生微生物的分离

1.在每套的三个平皿上标记所要的土壤样本和稀释度（1：

1000，1：

2000，1：

4000），并用你的收字母加以识别。

共标记二套。

2.把6支trypticasesoy琼脂试管放入水浴中加热至100℃，然后冷却至45℃保持。

3.按下法准备未知和阳性对照的1：

500土壤样品系列稀释度。

a.在三支试管上标记1，2和3，用吸管加5毫升自来水到每支试管中。

b.充分摇动所给1：

500土壤样品以得到均匀的土——水悬液。

c.用5毫升吸管，吸取5毫升1：

500稀释液到试管1中并混匀，稀释度为1：

1000。

d.用另一支吸管，从试管1中吸5毫升稀释液到试管2中并混匀，稀释度为1：

2000。

e.再用另一支吸管，从试管2中吸5毫升稀释液至试管3中，混匀，稀释度为1：

4000。

f.分别用1毫升吸管，吸取1毫升的1：

2000和1：

4000的稀释液到相应标记的平皿中。

g.每皿倒一管45℃的trypticasesoy琼脂培养基，轻轻转动混匀之。

h.使其固化

4.所有平板于25℃倒置保温2至4天。

5.保温后，用接种针从每个培养物中无菌分离有生长抑制圈的菌落于trypticasesoy琼脂斜面上。

6.将斜面于25℃保温2至4天，将其作为B部分的抗生素产生分离的原种培养物。

B部分分离物抗菌范围的确定

1.在trypticasesoy琼脂平板上标记上分离物的土壤样品来源。

2.用无菌技术，在琼脂平析用单线划线接种每种分离物。

接种线将平板分成两半。

3.将平板于25℃倒置保温3－5天。

4.保温后，在每个平板底部划四条垂直于抗生素产生分离物生长线的直线。

5.按每个平板上的底部描线，无菌划线接种四种供试培养物，从靠近（但不接触）抗生素产生分离物的生长处开始，划向平板的边缘。

6.平板于37℃倒置保温24小时。

实验三豆科植物根瘤中根瘤菌的分离

1.观察根瘤和类菌体

2.从根瘤中分离根瘤菌

不同的根瘤菌感染相应的豆科植物根部形成根瘤。

根瘤是根瘤菌和豆科植物的共生组织，它能大量地同化大气分子态氮，供豆科植物用，同时豆科植物为根瘤提供所需营养成分。

根瘤菌在根瘤中是以类菌体的形式存在。

虽然土壤中存在很多根瘤菌，但如果从土壤中进行分离，则很难鉴别。

最简单的方法就是从根瘤中进行分离。

本实验选用大豆植株根系上的根瘤进行大豆根瘤菌的分离。

植株：

接种了根瘤菌的生长30天左右的大豆植株。

每实验组1瓶150毫升结晶甘露醇酵母琼脂培养基，4支甘露醇酵母琼脂斜面，5支10毫升无菌水。

试剂：

95％酒精，0.1％升汞。

无菌培养皿，无菌眼科剪、眼科镊，接种环。

1.挖取植株根系，带土放入水中浸泡，稍后抖掉泥土，用水冲洗，获得带瘤根系。

2.选择根系主根上部发育健壮，饱满呈红色的根瘤，用眼科剪将根瘤剪下，剪下时稍带一些根，以保持根瘤的完整性。

3.为去除根瘤表面的杂菌，将剪下的根瘤浸入95％酒精中5分钟，然后再转入0.1％升汞中5分钟。

4.无菌操作，将根瘤放入无菌水中浸洗，振摇5分钟，重复4次。

5.将灭菌清洗干净的根瘤放置于无菌培养皿中。

6.用无菌镊子将根瘤压碎，流出浆液。

用1毫升无菌吸管吸1毫升无菌水与浆液混匀，制成悬液。

7.按下法进行四路划线分离

a.取一环菌悬液在甘露醇酵母琼脂平板图示区域1表面划3次。

b.灼烧接种环并使其冷却，把平板转90°

，把接种环放置区域1的角上，交叉在区域1的划线上，在图示区域2上划3次。

c.再次灼烧接种环，并冷却之，再将平板转90°

，从区域2的角上，按上法在区域3上划线。

d.不再灼烧接种环，再将平板转90°

，从区域3的角上划线至区域4。

8.将平板倒置，于28℃保温4－7天。

9.另将菌悬液涂片，供观察。

实验四感病死亡昆虫中杀虫细菌的分离

一、实验目的：

掌握病原细菌的分离方法

二、实验原理：

大多数病原细菌使昆虫致死的方式是一旦进入血腔，就会引起败血症。

一般死虫体内充满乳糜状液样物，因此将昆虫体内的体液接种到合适的培养基上，就能达到分离病原细菌的目的。

死亡昆虫：

感染苏云金杆菌致死的虫尸

营养琼脂培养基平板，5支10毫升无菌水试管，营养琼脂斜面。

试剂:

75%酒精，0.1%升汞，石炭酸复红染液，MBB染液。

无菌平皿，镊子，玻棒，无菌吸管，接种环。

1.将虫尸放入75％酒精中浸泡5分钟，然后移入0.1％升汞溶液中浸泡5分钟，除去虫尸表面杂菌。

2.无菌操作下，将虫尸在无菌水中清洗，重复4次。

最后就虫体置于无菌平皿中。

3.用灭菌的镊子或玻棒将表面经过清洁的虫体捣烂。

加入少量无菌水（1－2毫升）用接种环混匀，制成含菌悬液。

4.取菌悬液在营养琼脂平板上进行划线分离。

5.于30℃下将平板倒置保温24至48小时。

6.无菌操作下，调取划线平板上的单个菌落接种于营养琼脂斜面上。

7.培养物于30℃保温24小时。

实验五果浆中酵母菌的分离

学习利用加富培养基进行酵母菌的分离

加富培养是在培养基中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长繁殖的条件，使所需微生物大量繁殖，增加分离到这种微生物的机率。

利用加富培养基（乳酸豆芽汁培养基）创造酵母菌适宜的生长条件，使其迅速繁殖。

从烂水果果浆中很容易分离出酵母菌，利用在液体培养基中酵母菌蓖霉菌生长快，而酸性条件又能抑制细菌的生长的特性，用乳酸豆芽汁培养基可获得酵母菌的增殖培养，达到分离酵母菌的目的。

烂水果：

烂苹果或烂梨子

2管5毫升乳酸豆芽汁蔗糖培养液，Sabouraud琼脂培养基平板和斜面。

酒精灯、接种环、无菌1毫升吸管。

1.标记二管乳酸豆芽汁培养液试管为管1和管2。

2.取烂水果，用接种环跳取烂水果果浆少许接种于管1乳酸豆芽汁蔗糖培养液中。

3.接种试管于28℃下保温24小时。

4.无菌操作，用1毫升无菌吸管吸取管1培养后的底层培养物0.1毫升转入到管2乳酸豆芽汁培养液中。

5.管2于28℃保温24小时。

6.用接种环在管2中取一环培养物在Sabouraud琼脂平板上进行划线分离。

7.划线平板于28℃倒置保温2天。

8.在Sabouraud琼脂划线平板上挑取单菌落接种至Sabouraud琼脂斜面上。

9.斜面于28℃保温2天。

实验六污水中噬菌体的分离

一、实验目的:

从污