细胞工程复习资料Word文档格式.docx

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为正常的二倍体核型；

③酶活性检测：

ES细胞内端粒酶和碱性磷酸酶活性高；

④细胞表面标志物检测：

ES细胞膜表面有特殊的标记：

如，OCT-4，SSEA-3,SSEA-4等；

⑤体内分化潜能：

植入裸鼠皮下，可诱发形成畸胎瘤；

可分化为三个胚层的细胞；

能参与嵌合体的形成；

⑥体外分化潜能：

可形成类胚体，可在体外诱导分化为三个胚层的细胞。

5、体外培养细胞有哪些类型？

其生长特点有什么区别？

（一）体外细胞培养物的生长类型

体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。

粘附型细胞:

附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。

是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。

按照培养细胞粘附生长时的主要形态，主要分两类：

上皮细胞型和成纤维细胞型，其它为不定型（游走型细胞、多形型细胞）。

上皮细胞型：

来源于外胚层，内胚层细胞，类似体内的上皮细胞，呈扁平不规则多角形，中有圆形核。

生长特点：

易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状，生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动

成纤维细胞型：

由中胚层间充质组织起源的组织，似体内成纤维细胞的形态，呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核

排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动。

游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起

悬浮型细胞:

不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。

特点：

在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团。

优点：

生存空间大，提供数量大，传代方便（不需消化），易于收获，可获得稳定状态。

缺点：

观察不方便

，很多细胞不能悬浮生长（尤以正常细胞）。

6、培养细胞的生长特点

（一）贴附：

基本生长特点。

（细讲以成纤维细胞为例P39）

（二）接触抑制:

一种由细胞接触而抑制细胞运动的现象。

可作为区别正常细胞与癌细胞（无接触抑制）标志之一

（三）密度抑制：

当细胞密度逐步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多，细胞因营养的枯竭和代谢的影响，而分裂停止的现象。

7培养细胞的生长和增殖过程

组织培养细胞生命期

所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。

包括原代培养期、传代培养期及衰退期。

原代培养期：

也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。

细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。

与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。

传代期：

当细胞增殖达到一定密度后需要分离出一部分细胞和更新营养液，以继续细胞的生存的过程叫传代。

初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系。

在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。

衰退期：

此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。

（2）体外培养细胞一代生存期

所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。

每代细胞一般要经过三个生长阶段。

问题1、什么是原代培养与传代培养？

原代细胞培养有哪些方法？

各自的适用范围是什么？

原代培养也称初代培养期，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1～4周。

传代培养是指原代细胞生长一定时间后，如是贴附型细胞就会连接成片而铺满瓶底，这时需将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程称为传代，初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。

（课本54页）原代细胞培养的方法有：

组织块培养法、单层细胞培养法、悬浮细胞培养法。

组织块培养法特别适合于组织量少的原代培养；

单层细胞培养法尤其适用于细胞建系和大量组织的培养，用于少量培养工作时稍显繁琐；

悬浮细胞培养法对悬浮生长的细胞如白细胞、骨髓细胞和胸水、腹水等癌细胞，可直接接种进行原代培养。

2、常用的组织细胞分离方法有哪几种？

分散组织的方法有机械法分离和消化分离法两种；

根据组织种类和培养要求，宜采用相应的方法。

（1）.机械分离法：

A.离心分离法B.切割分离法C.机械分散法；

（2）.消化分离法：

A.胰蛋白酶消化法B.胶原酶消化法C.EDTA（螯合剂消化法

3、贴壁细胞传代时采用何种方法？

其技术关键是什么？

答：

贴壁细胞传代时采用消化分离法，其技术关键是把握好传代时机，消化时间要适度，消化液浓度要适宜，传代的细胞接种数量可适当多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖，部分贴壁生长细胞不经消化处理直接进行吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。

4、常用的动物细胞大规模培养主要有哪些操作模式？

各有哪些优缺点？

操作模式：

可采用分批式操作、流加式操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作等多种操作方式进行培养。

分批式操作：

将细胞扩大培养后，一次性将细胞和培养液投入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其他成分，待细胞增长和产物积累到适当的时间，一次性对细胞、产物、培养基进行收获，从中分离所需物质。

该操作简单、培养周期短、污染和细胞突变的风险小，既能直观地反应细胞生长代谢的过程，又可直接放大，是进行动物细胞培养工艺条件研究常用的手段。

流加式操作：

细胞持续生长至较高的密度，整个培养过程没有流出或回收，细胞或产物达到所需指标后终止培养，一次性回收整个反应体系，分离纯化产品。

半连续式操作：

培养物的体积逐步增加；

可进行多次收获；

细胞可维持指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可持续到很长时间。

连续式操作：

细胞维持持续指数增长，产物体积不断增长，可控制衰退期和下降期。

其不足是，由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染，在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异，对设备、仪器的控制技术要求较高。

灌流式操作：

细胞截留系统可使细胞保留在反应器内，维持较高的细胞密度，提高产品的产量；

连续灌流细胞使细胞稳定地处于较好的营养环境中，有害代谢废物得以及时清除；

反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；

产品在灌内停留时间短，可及时回收，有利于保持产品的活性。

8、细胞融合的意义

理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。

这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义；

融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径；

体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统；

淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。

9、细胞融合的常用方法

（一）仙台病毒法

病毒促使细胞融合的主要步骤如下：

两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；

通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；

两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；

进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。

优点是易得，用法简单，融合效果稳定。

（二）聚乙二醇（PEG）法

PEG的作用机理：

由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；

另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。

PEG诱导融合的特点：

其优点是融合成本低，勿需特殊设备；

融合子产生的异核率较高；

融合过程不受物种限制。

其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

（三）电融合法

电融合法原理：

在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。

电融合法的优点：

融合率高、重复性强、对细胞伤害小；

装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；

免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。

电融合的基本过程：

细胞膜的接触：

当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；

膜的击穿：

原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

问题简述筛选融合细胞的主要方法与原理（各种方法的原理？

）

利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为等标志，建立了多种选择选择系统，最常用的是酶缺陷型HAT选择培养法。

酶缺陷型：

将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；

未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。

因此存活下来的只有融合细胞。

营养缺陷型：

营养缺陷型是指一些细胞在合成某些营养物上有缺陷，在缺乏必须营养物的培养基中难以生存。

将不同营养缺陷型的细胞生成杂交细胞，这些细胞通过融合后基因互补得以在缺乏相应营养物的培养基中得以生存，而未融合细胞由于代谢受阻而死亡，由此可以将融合细胞分离出来。

温度敏感性：

利用突温度敏感性：

培养的哺乳动物细胞可在32℃～40℃之间的范围内存活（最适温度为37℃）变获得不能在非许可温度（如38℃～39℃）中生长的温度突变型细胞，利用与温度敏感突变细胞融合的杂交细胞，采用非许可温度下进行选择培养，就可将融合的杂交细胞筛选出来。

形态和行为标志：

若亲本细胞形态明显不同，识别异核细胞并不困难。

例如，鸡红细胞与HeLa细胞融合，它们的核不仅大小和形态不同，而且鸡红细胞的核相当浓缩；

HeLa细胞核染色质则比较弥散。

问题1、简述单克隆抗体的制备过程及主要原理。

针对某一抗原物质A设计一个研究方案，并制备相应的单克隆抗体。

原理：

在体液免疫反应中，一个抗原分子上可能含有许多抗原决定簇（即表位），每个淋巴细胞都会产生针对一个抗原决定簇的特异性抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。

大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。

基本过程：

先免疫动物，分离脾细胞，准备骨髓瘤细胞的准备，细胞融合，筛选与克隆融合细胞，最后大量制备单克隆抗体。

方案：

免疫动物：

将处理好的抗原多次注射到BALB/c小鼠体内，每隔2天注射一次，第3~5天进行试采血检验血清中的抗体，同时可用脾内注射培养基轻轻挤压使淋巴细胞逸出的方法采集淋巴细胞（大多为B细胞）

细胞富集：

将抗原包被在培养板或其他基质上，然后与脾细胞结合，那些表面具有特异性抗体的B细胞与抗原结合使得B细胞黏附于培养板或基质上，轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞为具有特异性抗体的B细胞

骨髓癌细胞的准备：

用BALB/c小鼠的653。

细胞融合：

用PEG诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞间进行融合，操作在10min内完成；

融合后马上以HAT培养，能活下来的大多为B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。

未融合的骨髓瘤及骨髓瘤细胞间相