水稻转基因实验技术手册文档格式.docx

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GUS

RNAi

第八章水稻组织培养

第九章原位杂交

第十章石蜡切片技术

第十一章扫描电子显微镜

附录：

第一章SDS-DNA微量提取法

1、取新鲜叶片5cm左右于1.5ml离心管中，加入液氮研磨（电钻）。

2、加入700μl预热至65℃的SDS抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min。

3、加入200μl5MKAc，颠倒混匀，-20℃冰浴30min后，10,000rpm离心5min，将上清夜倒入另一新的1.5ml离心管中。

注：

若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。

4、加入等体积的异丙醇（700μl），-20℃冰浴30min，11,000rpm离心5min。

5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。

6、将风干的DNA溶于100μlTE溶液中，55℃水浴溶解1h，再室温放置1d。

实验准备：

溶液配制：

SDS-抽提液：

1MTris-HCl：

100ml

5MNaCl：

0.5MEDTA：

10%SDS：

125ml

TE（pH8.0）：

1MTris-HCl（pH8.0）：

5ml

0.5MEDTA（pH8.0）：

1ml

第二章PCR

PrimeSTARHSDNAPolymerasewithGCBuffer&

TaKaRaLATaqwithGCBuffer

PCR体系和程序

第四章琼脂糖凝胶DNA回收

*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇

1、在长波紫外下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。

2、将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。

先称一个空1.5ml离心管重量，然后放入凝胶块后再称一次，两次重量相减得到凝胶的重量。

3、加3倍体积溶胶/结合液DB。

如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入300μl溶胶液；

如果凝胶浓度大于2%，应加入6倍体积溶胶液，凝胶块最大不能超过400mg，如果超过400mg，请用多个离心柱进行回收。

4、56℃水浴10min（直至完全溶解，每2-3min涡旋震荡一次帮助加速溶解。

）

时间可延长，溶解更彻底。

5、每100mg最初的凝胶重量加入150μl的异丙醇，震荡混匀。

加入异丙醇可以提高回收率，加入后不离心，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入有时反而可能降低回收效率。

6、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。

如果总体积超过750μl，可分两次将溶液加入同一个吸附柱AC中。

7、加入700μl漂洗液WB（先检查是否已加无水乙醇），12,000rpm离心1min，弃掉废液。

8、加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃掉废液。

9、将吸附柱AC放回空收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10、取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入50μl洗脱液缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2min，12,000rpm离心1min，如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min。

放置室温时间可延长至5-10min，离心时间可延长至2min。

洗脱液体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于30μl，体积过小会降低DNA洗脱效率，减少产量。

第五章质粒提取

1、取1.5ml菌液放入离心管（1.5ml），菌体少，可重复加入菌液

12,000rpm离心1min室温

2、去上清，倒扣于卫生纸上，用力扣出培养液，尽量去除上清

3、加入120μlSolI（预冷），涡旋悬浮，冰浴3min

SolutionI：

50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。

溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15min，储存于4℃冰箱。

4、加入240μlSolⅡ，碱变性时间3-5min，盖紧盖子，柔和颠倒5次，置于冰上1-2min，不宜过长。

SolutionⅡ（2%SDS：

0.4MNaOH=1：

1现配现用（预冷））

5、加入180μl预冷的SolⅢ，温和颠倒5次（10s），5min

SolutionⅢ：

5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。

溶液终浓度为：

K+3mol/L，Ac-5mol/L。

12,000rpm离心5min

6、将上清移入新管

7、加等量（500μl）的Tris平衡酚：

氯仿（1：

1）（现配现用，有毒，戴手套），振荡混匀

吸取Tris平衡酚溶液时，要吸下层黄色液体。

4℃，12,000rpm离心3min

8、用移液器吸取上清液（最上一层）400μl-500μl（450μl）

9、加2倍体积（900μl）无水乙醇（-20℃预冷），振荡混合，室温放置30min以上，越久越好（40min-60min）

10、倒出上清，倒扣于纸上（须除尽液滴，否则影响酶切）

11、用1ml70%EtOH，漂洗

12,000rpm4℃，离心3min

12、去上清，超净工作台上风干0/N

13、加入15μl（RNase+ddH2O）MIX（含RNase20μg/ml），37℃水浴溶解30min

质粒提取实验准备

质粒抽提试剂

RNaseA：

10mg/ml溶于TE中，在沸水中煮10－30分钟之后分成小份储存于-20℃

pMD-18T载体连接体系

5μl

T-vectorSample：

1μl

PCR产物：

4μl

Total：

10μl

若扩大体系，solutionI的比例不变，T-vectorSample减少，PCR产物增加

例：

15μl体系

7.5μl

6.5μl

15μl

注释：

平末端产物加A

体系60μl

ExBuffer：

6μl

dATP：

5μl

Ex：

1μl

PCR产物：

30μl

ddH2O：

18μl

程序：

72℃30min

双酶切体系

参考体系50T1302

DNA30μl→40→30

BglⅡ1μl→1.5→1.5

SpeI1μl→1.5→1.5

10×

Buffer5μl→4.7→3.7

ddH2O13μl→0→0

37℃反应6h，产物于1.0%琼脂糖凝胶检测回收DNA

表达载体与目的基因连接

T4DNALigaseBuffer：

2.5μl

DNA片段：

约0.3pmol

载体DNA：

约0.03pmol

T4DNALigase：

dH2Oupto25μl

16℃过夜反应→加入2.5μl（1/10量）的3MCH3COONa（pH5.2）→加入62.5μl

DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍，平滑末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。

CaCl2制备感受态细胞（DH5α、DH10B、TOP10）

1、前夜挑单菌落E.coli于20mlLB液体培养基中，37℃，150-160rpm振荡培养过夜

2、取0.3ml过夜培养的菌液接种于30ml液体LB培养基中，37℃，150-160rpm振荡培养2.5-3h

3、将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷，以上步骤在超净工作台和冰上操作

4、吸取1.4ml培养菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却15min

5、4℃，5,000rpm离心10min

6、弃上清，加入100μl预冷的CaCl2溶液，用移液器轻轻上下吸打悬浮，然后冰上放置30min

7、4℃，5,000rpm离心10min

8、弃上清，加入100μl预冷的CaCl2溶液（含15%-20%甘油），用移液器轻轻上下吸打悬浮

9、-70℃冰箱保存备用

转化E.coli

预备实验：

开紫外（20min）、水浴锅（42℃）、将800μlLB分装于1.5ml离心管（37℃预热）

实验步骤：

1、从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞，用体温融化，冰浴10min

2、取100μl感受态细胞+5μl连接产物，轻弹

冰浴20min→42℃热击60—90s→冰浴1-2min

3、全部移入37℃温浴的800μlLB中，摇菌160-170rpm，70min

4、将摇好的菌离心（11,000rpm，1min），倒出上清液，留约100μl上清液，用移液器打匀后进行涂布于LB平板（含100μg/mlAMP），37℃，O/N

5、摇菌：

挑2-3个阳性克隆，接于20-30mlLB培养基+20-30μlAMP（100mg/ml），150-250rpm振荡培养8-10h

6、收集菌体，分装保存

7、菌液PCR检测阳性克隆+阳性对照（含目的序列的模板）+阴性对照（用水替代菌液）

0.1mol/LCaCl2溶液：

称取0.54gCaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。

含15%甘油的0.1mol/LCaCl2：

称取0.54gCaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。

Amp（100mg/ml）：

1gAmp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存

LB液体培养基

LB平板和LB+AMP平板

农杆菌感受态制备

1、挑取单菌落接种于5ml含rif的YEB液体培养基中，28℃，振荡摇菌培养O/N

2、取2ml（2-5ml）以上种子液转入50mlYEB液体培养基中（含rif），继续培养5-6h

3、转入无菌离心管，冰浴30min

4、4℃，5,000rpm离心5min，弃上清

5、加入200-300μl20mMCaCl2溶液悬浮，并用移液器吸打混匀

6、4℃，5,000rpm离心5min，弃上清

7、加入200μl20mMCaCl2溶液悬浮，可4℃保存过夜后使用或添加冷冻保护剂-70℃贮存备用。

转化农杆菌

1、取5μl（2μl）纯化的重组质粒DNA（连接号的产物）与制备的感受态细胞（100μl）混合

2、冰浴20min，转入液氮冷冻（1-5min）或-70℃（5-10min）后，迅速置于3