水稻转基因实验技术手册文档格式.docx

1、GUSRNAi第八章 水稻组织培养第九章 原位杂交第十章 石蜡切片技术第十一章 扫描电子显微镜附录：第一章 SDS-DNA微量提取法1、 取新鲜叶片5cm左右于1.5ml离心管中，加入液氮研磨（电钻）。2、 加入700l预热至65的SDS抽提液，迅速搅匀后置于65水浴30min。3、 加入200l 5M KAc，颠倒混匀，-20冰浴30min后，10,000rpm离心5min，将上清夜倒入另一新的1.5ml离心管中。注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。4、 加入等体积的异丙醇（700 l），-20冰浴30min，11,000rpm离心5min。5、 弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。6、

2、 将风干的DNA溶于100 l TE溶液中，55水浴溶解1h，再室温放置1d。实验准备：溶液配制：SDS-抽提液：1M Tris-HCl：100ml5M NaCl：0.5M EDTA：10% SDS：125mlTE（pH8.0）：1M Tris-HCl（pH8.0）：5ml0.5M EDTA（pH8.0）：1ml第二章 PCRPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章 琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下，用干

3、净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。2、将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。先称一个空1.5ml离心管重量，然后放入凝胶块后再称一次，两次重量相减得到凝胶的重量。3、加3倍体积溶胶/结合液DB。如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100l，则加入300 l溶胶液；如果凝胶浓度大于2%，应加入6倍体积溶胶液，凝胶块最大不能超过400mg，如果超过400mg，请用多个离心柱进行回收。4、56水浴10min（直至完全溶解，每2-3min涡旋震荡一次帮助加速溶解。）时间可延长，溶解更彻底。5、每100mg最初的凝胶重量加入150 l的异丙醇，

4、震荡混匀。加入异丙醇可以提高回收率，加入后不离心，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入有时反而可能降低回收效率。6、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。如果总体积超过750 l，可分两次将溶液加入同一个吸附柱AC中。7、加入700 l漂洗液WB（先检查是否已加无水乙醇），12,000rpm离心1min，弃掉废液。8、加入500 l漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃掉废液。9、将吸附柱AC放回空收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。10、取出吸附柱AC，

5、放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入50 l洗脱液缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70水浴中加热效果更好），室温放置2min，12,000rpm离心1min，如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min。放置室温时间可延长至5-10min，离心时间可延长至2min。洗脱液体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于30 l，体积过小会降低DNA洗脱效率，减少产量。第五章 质粒提取1、取1.5ml菌液放入离心管（1.5ml），菌体少，可重复加入菌液 12,000rpm 离心1min 室温2、去上清，倒扣于卫生纸上，

6、用力扣出培养液，尽量去除上清3、加入120l Sol I（预冷），涡旋悬浮，冰浴3minSolution I：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl （pH8.0）， 10mmol/L EDTA （pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15min，储存于4冰箱。4、加入240l Sol，碱变性时间3-5min，盖紧盖子，柔和颠倒5次，置于冰上1-2min，不宜过长。Solution（2%SDS：0.4M NaOH=1：1 现配现用（预冷）5、加入180l预冷的Sol，温和颠倒5次（10s），5minSolution：5mol/L KAc 60ml，冰醋酸

7、 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为： K+ 3mol/L，Ac- 5mol/L。 12,000rpm 离心5min6、将上清移入新管7、加等量（500 l）的Tris平衡酚：氯仿（1：1）（现配现用，有毒，戴手套），振荡混匀吸取Tris平衡酚溶液时，要吸下层黄色液体。 4，12,000rpm 离心3min8、用移液器吸取上清液（最上一层）400l-500 l（450 l）9、加2倍体积（900 l）无水乙醇（-20预冷），振荡混合，室温放置30min以上，越久越好（40min-60min）10、倒出上清，倒扣于纸上（须除尽液滴，否则影响酶切）11、

8、用1ml 70% EtOH，漂洗 12,000rpm 4，离心3min12、去上清，超净工作台上风干0/N13、加入15 l（RNase+ddH2O）MIX（含RNase 20g/ml），37水浴溶解30min质粒提取实验准备质粒抽提试剂 RNaseA： 10mg/ml溶于 TE 中，在沸水中煮1030分钟之后分成小份储存于-20pMD-18T载体连接体系5lT-vector Sample：1lPCR产物：4lTotal：10 l若扩大体系，solution I的比例不变，T-vector Sample减少，PCR产物增加例：15 l体系7.5l6.5l15 l注释：平末端产物加A体系 60l

9、Ex Buffer ： 6 ldATP ： 5 lEx ： 1 lPCR产物 ： 30 lddH2O ： 18 l程序：72 30min双酶切体系参考体系 50 T 1302DNA 30l4030Bgl 1 l1.51.5Spe I 1 l1.51.510Buffer 5 l4.73.7ddH2O 13 l0037反应6h，产物于1.0%琼脂糖凝胶检测回收DNA表达载体与目的基因连接T4 DNA Ligase Buffer： 2.5lDNA片段： 约0.3pmol载体DNA： 约0.03pmolT4 DNA Ligase：dH2O up to 25 l16过夜反应加入2.5l（1/10量）的3

10、M CH3COONa（pH5.2）加入62.5lDNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍，平滑末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。CaCl2制备感受态细胞（DH5、DH10B、TOP10 ） 1、 前夜挑单菌落E.coli于20ml LB液体培养基中，37，150-160rpm振荡培养过夜2、 取0.3ml过夜培养的菌液接种于30ml液体LB培养基中，37，150-160rpm振荡培养2.5-3h3、 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷，以上步骤在超净工作台和冰上操作4、 吸取1.4ml培养菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却15

11、min5、 4，5,000rpm离心10min6、 弃上清，加入100l预冷的CaCl2溶液，用移液器轻轻上下吸打悬浮，然后冰上放置30min7、 4，5,000rpm离心10min8、 弃上清，加入100l预冷的CaCl2溶液（含15%-20%甘油），用移液器轻轻上下吸打悬浮9、 -70冰箱保存备用转化E.coli预备实验：开紫外（20min）、水浴锅（42）、将800l LB分装于1.5ml离心管（37预热）实验步骤：1、从-70冰箱中取出一管感受态细胞，用体温融化，冰浴10min2、取100l感受态细胞+5l连接产物，轻弹冰浴20min42热击6090s冰浴1-2min3、全部移入37温

12、浴的800l LB中，摇菌160-170rpm，70min4、将摇好的菌离心（11,000rpm，1min），倒出上清液，留约100l上清液，用移液器打匀后进行涂布于LB平板（含100g/ml AMP），37，O/N5、摇菌：挑2-3个阳性克隆，接于20-30ml LB培养基+20-30l AMP（100mg/ml），150-250rpm振荡培养8-10h6、收集菌体，分装保存7、菌液PCR检测阳性克隆+阳性对照（含目的序列的模板）+阴性对照（用水替代菌液）0.1mol/L CaCl2溶液：称取0.54g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。含15%甘

13、油的 0.1mol/L CaCl2：称取 0.54g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，加入 15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。Amp（100mg/ml）： 1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20保存LB液体培养基LB平板和LB+AMP平板农杆菌感受态制备1、挑取单菌落接种于5ml含rif的YEB液体培养基中，28，振荡摇菌培养O/N2、取2ml（2-5ml）以上种子液转入50ml YEB液体培养基中（含rif），继续培养5-6h3、转入无菌离心管，冰浴30min4、4，5,000rpm离心5min，弃上清5、加入200-300l 20mM CaCl2溶液悬浮，并用移液器吸打混匀6、4，5,000rpm离心5min，弃上清7、加入200l 20mM CaCl2溶液悬浮，可4保存过夜后使用或添加冷冻保护剂-70贮存备用。转化农杆菌1、取5l（2l）纯化的重组质粒DNA（连接号的产物）与制备的感受态细胞（100l）混合2、冰浴20min，转入液氮冷冻（1-5min）或-70（5-10min）后，迅速置于3