高效液相色谱简介及操作_精品文档PPT资料.ppt

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荧光和电化学检测器可达0.1pg。

2.为什么叫高效液相色谱?

HPLC和经典液相色谱法的比较,3.高效液相色谱法的分类,通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。

4.如何阅读色谱图？

tR：

保留时间；

tM：

死时间；

：

调整保留时间；

W：

峰宽,定性分析：

在同一色谱系统中相同物质具有相同的保留值定量分析：

组分含量与其响应值（峰高或面积）成正比,5.如何评价色谱峰？

柱效：

描述被分离组分的集中程度。

柱效越高，组分越集中，对应色谱峰的峰宽越窄。

可用理论塔板高度H描述。

H越小，柱效越高。

选择性：

描述不同组分的分离程度。

选择性越高两个色谱峰顶相距越远。

用R表示,（a）柱效和分离度都不好；

（b）分离度高，柱效低；

（c）理想色谱峰,用分离度R可以描述选择性和柱效的总效能,R值越大，表明两组分的分离程度越高，R=1.0时，分离程度可达98%，R1.0时两峰有部分重叠，R=1.5时，分离程度达到99.7%.所以，通常用R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标.,分析未知物质-联用技术,色谱-质谱联用色谱-核磁共振联用色谱-傅氏转换红外线光谱分析仪联用,二、高效液相色谱仪的结构,液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统以及检测和记录系统四大部分组成。

此外，可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。

高效液相色谱仪结构流程图,1高压输液系统,高压输液系统有贮液器、高压泵及压力表等组成，核心部件是高压泵。

（1）贮液器,流动相贮液器，一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯塑料制成，常用体积为0.52L。

流动相溶剂放入贮液器之前必须经过过滤和脱气处理。

常用脱气方法：

超声脱气、加热脱气、真空脱气、吹氮脱气等。

（2）高压输液泵主要部件之一，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性，常用的压力范围：

（150350）105Pa。

输液泵应具备如下性能：

流量稳定；

流量范围宽；

输出压力高；

液缸容积小；

密封性能好，耐腐蚀。

高压泵的分类,往复式柱塞泵,分类,恒流泵,恒压泵,螺旋注射泵,柱塞往复泵,隔膜往复泵,2进样系统,进样方式：

注射器进样、阀进样、自动进样。

早期使用注射器进样，现在大都使用耐高压的六通阀进样或自动进样。

六通阀的结构：

色谱柱,是高效液相色谱的心脏。

柱管多用不锈钢制成。

两端的柱接头内装有筛板，防止填料漏出。

填料的粒度多为0.2-20m（5-10m）。

发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。

常规分析柱：

内径25mm（常用4.6mm，3.9mm），柱长1030cm（15cm，25cm居多）。

3分离系统,包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。

4检测系统,主要作用：

监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。

原理：

朗伯-比尔定律,a.紫外检测器（UVD）：

应用最广泛的检测器。

特点：

使用面广；

灵敏度高（检测下限为10-10gml）；

线性范围宽；

对温度和流速变化不敏感；

可检测梯度溶液洗脱的样品。

缺点：

只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。

b.示差折光检测器（RID）,原理：

监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度。

通用性检测器；

对温度变化比较敏感，要保持在0.001；

灵敏度低（10-6g）；

对溶剂变化敏感，不适用于梯度洗脱。

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。

目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。

c.荧光检测器（FLD）,原理:

某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。

特点:

选择性检测器，灵敏度比紫外检测器高2-3个数量级，可达到10-12g；

选择性好，对流量和温度敏感性低。

缺点：

只适合于能产生荧光的物质的检测。

只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。

d.蒸发光散射检测器（ELSD）,通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。

工作原理:

适用检测挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类，高级脂肪酸，磷脂，维生素，氨基酸，甘油三酯及甾体等。

适用范围：

5数据处理系统,该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

三、高效液相色谱基本操作步骤,

（1）检查电源线连接是否正确后打开电源开关

（2）泵体及流路内的气泡排除（3）正确连接色谱柱注意流向标志，切勿反接,（4）系统平衡第一步：

先用甲醇或乙腈冲洗流路约20分钟，平衡活化色谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。

第二步：

平衡色谱柱方法一：

若流动相为有机相与水相的混合物，则第一步完成后，按照分析样品的需要调节有机相与水相的比例后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。

方法二：

若流动相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸，则第一步完成后，先用95%的去离子水冲洗流路约20分钟后，再按照分析样品的需要调节流动相的比例，冲洗流路约30分钟，待基线走平后即可进样。

（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯）（6）测定样品（7）清洗仪器色谱柱及流路清洗进样阀清洗进样针清洗,四、主要注意事项,1泵使用的注意事项,防止任何固体微粒进入泵体（用0.22um或0.45um的微孔滤膜过滤）流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。

泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、密封圈，最终产生漏液。

输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。

流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性和分析结果。

2色谱柱使用的注意事项,3其他注意事项,色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。

当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般为甲醇）。

每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。

未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁止直接进样分析。

要注意流动相的脱气。

避免使用高粘度的溶剂作为流动相。

使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建议不超过两天，最好每天更换。

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