分子生物学的应用技术ppt_精品文档PPT课件下载推荐.ppt

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,2、环境因素激素、药物，细胞因子、机械刺激、病原体感染、电刺激、细胞转化.,研究基因表达的手段,1、RT-PCR（RNA）2、Northernblot（RNA）3、Westernblot（蛋白质）4、免疫组化（蛋白质）,原位杂交、点杂交、RNA酶保护试验基因芯片,1、RT-PCR,基本原理：

将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。

根据PCR产物的量，判断基因表达的强度。

RT-PCR是一种半定量方法,实验操作：

1）RNA提取：

Trizol试剂盒。

防止RNA降解,RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤。

2）逆转录：

RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，OligodT）,3）PCR,特异性引物、模板、Taq聚合酶。

通过PCR，将目的片段扩增几十百万倍。

在一定范围内和一定的条件下，PCR的产物量与模板量呈正比关系。

模板量,4）几个注意问题：

反应平台内参1、PCR效率差异，重复性2、内参选定3、共同扩增4、扩增片段长度5、mRNA丰度，目标片段与内参片段,iNOS（诱导型一氧化氮合酶）GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶）,5）PCR产物量的测定,应用图象分析软件进行密度测定。

100%,160%,ABCD,2.02.0,2.01.0,2.02.0,1.01.0,RT-PCR特点：

优点：

灵敏度高、特异性高、操作简便。

缺点：

可靠性差、不能细胞定位。

2、Northernblot,标记探针与膜固相RNA杂交。

根据杂交信号强弱判断表达量，根据杂交信号位置判断分子长度。

杂交信号,实验操作：

1）RNA提取2）RNA电泳（分离不同长度RNA）3）转膜（形成固相RNA）4）探针标记（同位素/非同位素）5）预杂交，杂交6）洗膜7）显影（放射性/酶促）,Northernblot特点：

因为没有扩增过程，Northernblot的结果可靠性高。

可以确定未知基因的转录产物（mRNA）长度。

1、操作烦琐2、同位素3、灵敏度低4、对RNA质量要求高5、不能定位细胞,3、Westernblot,标记抗体与膜固相蛋白作用。

根据信号强弱判断蛋白表达强度。

根据信号位置判断蛋白分子量。

标准分子量蛋白,特异性反应带,1）蛋白提取2）蛋白电泳（分离不同分子量蛋白）3）转移4）封闭5）一抗作用6）标记二抗（HRP/AP标记）作用7）显色,实验操作：

Westernblot特点：

直接检测蛋白质的表达量。

灵敏度低一抗制备难度大，购买价格高容易出现交叉反应不能细胞定位,4、免疫组化,标记抗体与组织细胞作用。

根据信号强弱判断表达强度，根据信号位置判断表达细胞。

eNOS表达,（对照）,（实验）,实验操作,1）组织切片（石蜡/冰冻）2）封闭，内源性过氧化物酶失活3）一抗作用4）二抗（HRP标记）作用5）显色6）复染，封片,免疫组化特点：

细胞定位,缺点：

定量不准确，人为因素干扰大（图象分析系统）,5、基因芯片,特定载体上密集的大量探针与荧光标记的样品反杂交。

根据杂交信号强弱判断基因表达强度。

基因芯片特点：

一次杂交可以得到大量表达信息。

通用性好。

成本高，需要专门设备。

人类基因组计划揭示了人类有34万个基因，转录本多达10万个。

基因不同时空表达是细胞结构和功能的基础；

是组织、器官和系统发育和分化的基础；

也是大多数细胞病变的基础。

了解不同状态下的基因表达调节机制是后基因组时代的主要任务，是探索生命本质的重要环节。

结束语,谢谢,