HPLC实验步骤和方法开发与应用技巧_精品文档PPT课件下载推荐.ppt

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肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激甾体药物研究中的应用：

肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。

素和孕激素等。

抗菌素类药物研究中的应用：

青霉素、头孢菌素、庆大毒素、抗菌素类药物研究中的应用：

青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。

四环素、氯霉素、诺氟沙星等。

中草药研究中的应用：

生物碱、甙类中草药研究中的应用：

生物碱、甙类（皂甙、强心甙、黄酮甙皂甙、强心甙、黄酮甙等等）、萜类、萜类手性药物手性药物研究中的应用：

光学异构体的拆分研究中的应用：

光学异构体的拆分（如解毒剂如解毒剂D-D-青霉青霉胺毒性小，胺毒性小，L-L-异构体毒性很强异构体毒性很强）医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。

医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。

v在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用HPLC的应用领域的应用领域在生物化学和生物工程中的应用在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类生物胺的分析研究（儿茶酚胺类）在精细化工分析中的应用在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析醇、醛和酮、醚的分离分析酸和酯的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究聚合物的分析研究药物、农药、染料、炸药等工业产品药物、农药、染料、炸药等工业产品HPLC的应用领域的应用领域化妆品行业要控制和分析：

化妆品行业要控制和分析：

防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；

在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要投毒药物、毒品分析等投毒药物、毒品分析等投毒药物、毒品分析等投毒药物、毒品分析等在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测类和胺类的检测类和胺类的检测类和胺类的检测在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析二二.方法开发的过程方法开发的过程Adaptedfrom:

Snyder,L.R.;

Kirkland,J.J.;

Glajch,J.L;

PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.21.1.得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标2.2.确定特定确定特定确定特定确定特定HPLCHPLC过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求3.3.选择合适的检测器选择合适的检测器选择合适的检测器选择合适的检测器4.4.选择选择选择选择HPLCHPLC方法；

初步分离；

建立最佳分离条件方法；

建立最佳分离条件5.5.优化分离条件优化分离条件优化分离条件优化分离条件6.6.检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要7.7.定量校正定量校正定量校正定量校正8.8.日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认第一步干什么第一步干什么?

想办法得到各种信息想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法品的分析方法查文献和方法，如查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-CA,AA,AOAC,EPA-仪器制造商的文献，如仪器制造商的文献，如Dionex,WatersDionex,Waters对色谱柱有足够的了解对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品充分了解您自己的样品分析时要了解哪方面的情况？

分析时要了解哪方面的情况？

灵敏度的要求有多高灵敏度的要求有多高?

样品的本底是否很复杂样品的本底是否很复杂?

有多少组份要分析有多少组份要分析?

对分析的精确度、准确度等有多高要求对分析的精确度、准确度等有多高要求?

是否因是日常检验，而要求方法容易使用是否因是日常检验，而要求方法容易使用?

分离分离（制备制备）时要了解哪方面的情况？

时要了解哪方面的情况？

要分离（即制备）的样品量有多大要分离（即制备）的样品量有多大?

要分离的组份在样品中的含量很高要分离的组份在样品中的含量很高?

还是微量还是微量?

是否需要保持生物活性是否需要保持生物活性?

对分离产物纯度的要求有多高对分离产物纯度的要求有多高?

纯度或活性的鉴定如何完成纯度或活性的鉴定如何完成?

使用文献方法注意点使用文献方法注意点色谱柱填料的种类、品牌是否相同色谱柱填料的种类、品牌是否相同?

注意文献方法的流动相注意文献方法的流动相是否损害色谱柱是否损害色谱柱?

如色谱填料品牌不同，需要调整流动相如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：

内径、柱长注意色谱柱的规格：

内径、柱长需要调整流速、进样量需要调整流速、进样量注意梯度条件注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）了解系统的滞后体积（梯度）一）选择一）选择HPLC检测器检测器对样品有响应并有一个输出信号对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；

并且所设计的校正技术应该促进这种关系关系；

并且所设计的校正技术应该促进这种关系但是：

但是：

由于受由于受HPLCHPLC系统其他部件的影响会产生响应与系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象浓度之间关系的与线性偏离现象并不是所有的检测器是线性的并不是所有的检测器是线性的受受HPLCHPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距能与其最佳水平有较大的差距用于用于HPLC的检测器的检测器没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！

色谱分离！

HPLCHPLC检测器可以分为：

检测器可以分为：

溶质性质检测器（选择型）溶质性质检测器（选择型）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）动相的变化（选择型）整体性质检测器（通用型）整体性质检测器（通用型）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）化作出响应（通用型）理想的理想的HPLC检测器检测器高灵敏度；

可忽略的基线噪音高灵敏度；

可忽略的基线噪音宽的线性范围宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速等变化不敏感对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性长时间操作的稳定性低死体积低死体积非破坏性非破坏性选择性选择性灵敏度：

信噪比灵敏度：

信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；

即峰高与基线噪音灵敏度是信号与噪音的比值；

即峰高与基线噪音的比值（的比值（S/NS/N）检测限（检测限（LODLOD）：

）：

S/N=3S/N=3定量限（定量限（LOQLOQ）：

S/N=10S/N=10好的信噪比有利于：

好的信噪比有利于：

更好的色谱峰确认更好的色谱峰确认更好的定量更好的定量更好地完成色谱峰纯度更好地完成色谱峰纯度/均一性均一性6:

1NS选择液相色谱的检测器选择液相色谱的检测器要考虑的因素：

要考虑的因素：

你要分离的化合物你要分离的化合物/样品的化学特性样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等化学结构、分子量及紫外光谱等等流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）梯度还是等度梯度还是等度灵敏度需求灵敏度需求是否有双检测的需求是否有双检测的需求选择液相色谱的检测器选择液相色谱的检测器通用检测器通用检测器RIELSDMS灵敏度ugngpg线性范围104否103流速敏感是否是温度敏感是否否破坏性否是是选择性检测器选择性检测器ABSFLECCondMS灵敏度ngpgfgpgpg线性范围105103106105103流速敏感否否是是是温度敏感否否是是是破坏性否否是否是吸光度（吸光度（UV/Vis）检测原理检测原理原理：

基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收原理：

基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：

比耳定律，定量基础：

比耳定律，AAKCLKCL优点：

优点：

11）对温度和流速不敏感）对温度和流速不敏感）对温度和流速不敏感）对温度和流速不敏感22）可用于梯度洗脱）可用于梯度洗脱）可用于梯度洗脱）可用于梯度洗脱33）灵敏度较高，灵敏度较高，灵敏度较高，灵敏度较高，ngng级检测级检测级检测级检测缺点：

选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质缺点：

选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质吸光度（吸光度（UV/Vis）检测的应用检测的应用大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器检测器-多数公司售出的检测器中多数公司售出的检测器中75%以上是以上是吸光度检测器（其中吸光度检测器（其中50%以上是紫外以上是紫外/可可见检测器，见检测器，25%是是PDA）背景吸