实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测PPT推荐.ppt

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在一起。

l当加入当加入乙酸钾乙酸钾恢复至恢复至中性中性时，染色体时，染色体DNA分子难以复性，而分子难以复性，而质粒质粒DNA分子分子很快复性很快复性，离心时离心时染色体染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀与细胞碎片一起被沉淀出来出来，而，而质粒质粒DNA则则留在上清液留在上清液中。

中。

l用用异丙醇异丙醇或或乙醇沉淀乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯后洗涤，可得到较纯的质粒的质粒DNA。

载体结构的三大要素载体结构的三大要素：

多克隆位点多克隆位点选择标记（耐药性，选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位独立的复制单位载体种类载体种类：

质粒质粒噬菌体噬菌体酵母人工染色体酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体反转录病毒载体表达载体等表达载体等pBCpBCSKmapSKmap三、实验仪器、材料与试剂三、实验仪器、材料与试剂

（一）

（一）仪器仪器1.恒温摇床恒温摇床2.超净工作台超净工作台3.高压灭菌锅高压灭菌锅4.高速台式离心机高速台式离心机5.微量取液器、微量取液器、1.5mLEP管管6.LB液体和固体培养基液体和固体培养基7.卷纸、无水乙醇、双蒸水卷纸、无水乙醇、双蒸水

（二）

（二）材料和试剂材料和试剂1.含含pUM-T（pMD18-T或或KS，pRT101）质质粒的大肠杆菌粒的大肠杆菌DH10B（DH5或或HB101）。

）。

2.含外源基因的重组含外源基因的重组pUM-T（pMD18-T或或KS，pRT101）质粒的大肠杆菌质粒的大肠杆菌DH10B（DH5或或HB101）。

3.氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）：

用无菌水配制成）：

用无菌水配制成50-100mg/ml溶液，置溶液，置-20冰箱保存冰箱保存备用。

备用。

pMD18-TVector4.LB液体培养基液体培养基（1L）：

）：

胰蛋白胨胰蛋白胨10g,酵母提取物酵母提取物5g,NaCl10g。

加去离子水至加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，搅拌，使溶质完全溶解，用用NaOH调节调节pH值至值至7.0，加入去离子水至，加入去离子水至总体积为总体积为1升，高压蒸汽灭菌升，高压蒸汽灭菌20分钟。

分钟。

5.LB固体培养基（固体培养基（1L）：

在上述在上述LB液体培养基（液体培养基（1L）中加入）中加入琼脂粉琼脂粉（Agar）15g。

四、实验步骤四、实验步骤百泰克高纯质粒小量制备试剂盒百泰克高纯质粒小量制备试剂盒u第一次使用前请先在第一次使用前请先在15ml（25ml）漂洗液漂洗液WB中加入中加入45ml（75ml）无水乙醇无水乙醇!

u将将RNaseA全部加入溶液全部加入溶液P1中，中，混匀混匀，每次，每次使用后置于使用后置于2-8保存保存。

1.取取1.5-4.5毫升毫升过夜培养的菌液，过夜培养的菌液，9000rpm，离心离心30秒秒，弃上清，收集菌体弃上清，收集菌体，尽可能的尽可能的倒干上清倒干上清。

处理超过处理超过1.5毫升菌液可以离心去上清后，毫升菌液可以离心去上清后，在同一个在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复管内加入更多的菌液，重复步骤步骤1，直到收集到足够的菌体。

，直到收集到足够的菌体。

2.用用250l溶液溶液P1重悬菌体沉淀重悬菌体沉淀，涡旋振涡旋振荡荡至彻底悬浮。

至彻底悬浮。

如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和致提取量和纯度偏低。

纯度偏低。

3.加加250l的溶液的溶液P2，温和的温和的上下翻转上下翻转6-10次次使菌体使菌体充分裂解充分裂解，直到溶液变得，直到溶液变得清亮清亮。

温和的混匀，不要剧烈震荡，温和的混匀，不要剧烈震荡，以免基因组以免基因组DNA剪切断裂！

剪切断裂！

所用时所用时不应超过不应超过5分钟分钟！

以免！

以免质粒受到破坏。

此时菌液应变得质粒受到破坏。

此时菌液应变得清亮粘稠清亮粘稠，如，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。

果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。

4.加加400l溶液溶液P3，立即温和立即温和的上下翻转的上下翻转6-10次次，室温，室温放置放置5分钟分钟。

室温。

室温13，000rpm离心离心10分钟分钟，小心小心取上清。

取上清。

5.（将将吸附柱吸附柱安置于安置于收集管收集管上，加入上，加入500l溶液溶液P4，室温，室温13,000rpm离心离心1分钟分钟，弃滤液；

弃滤液；

）将将上一步所得上清液上一步所得上清液加入吸附柱加入吸附柱AC中中（吸附柱放入收集管中），（吸附柱放入收集管中），13,000rpm离心离心1分钟分钟，弃滤液。

，弃滤液。

6.加入加入500l去蛋白液去蛋白液PE，13,000rpm离心离心30-60秒秒，弃滤液。

此步骤为了此步骤为了去除痕量核酸酶去除痕量核酸酶等杂质，如所用等杂质，如所用菌株为菌株为JM系列、系列、HB101等，因为核酸酶含量等，因为核酸酶含量丰富，应加此步骤；

如所用菌株为丰富，应加此步骤；

如所用菌株为XL-1Blue和和DH5等，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。

等，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。

7.加入加入500l漂洗液漂洗液WB（请先检查是否已（请先检查是否已加入加入无水乙醇无水乙醇！

），！

），13,000rpm离心离心30-60秒秒，弃滤液。

8.重复重复步骤步骤7一次，一次，13,000rpm离心离心30-60秒秒，弃滤液。

弃滤液。

9.空柱空柱13,000rpm离心离心2分钟分钟。

室温室温放置放置3-5分钟分钟，除去残留乙醇。

，除去残留乙醇。

9.取出吸附柱取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管，放入一个干净的离心管中，在中，在吸附膜的吸附膜的中间部位中间部位加加60-100l洗脱缓洗脱缓冲液冲液EB或或双蒸水双蒸水（洗脱缓冲液事先在（洗脱缓冲液事先在65-70水浴中加热效果水浴中加热效果更好）更好）,室温室温放置放置1分钟分钟，13,000rpm离心离心1分钟分钟洗脱质粒洗脱质粒DNA，可立即，可立即用于下游分子生物学实验或用于下游分子生物学实验或-20保存。

保存。

洗脱体积洗脱体积越大，洗脱效率越高越大，洗脱效率越高，如果需要质粒，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小不应最小不应少于少于50l，体积过小降低质粒洗脱效率体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒，减少质粒产量。

产量。

五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论1.实验结果实验结果2.讨论讨论附附II：

碱法提取质粒的原理和方法：

碱法提取质粒的原理和方法（一一）试剂等试剂等1.Solution50mmol/L葡萄糖葡萄糖25mmol/LTris.Cl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）高压灭菌后，高压灭菌后，4保存备用。

保存备用。

2.Solution（现用现配制现用现配制）0.2mol/LNaOH1%SDS3.Solution（100ml）：

5mol/LKAc60ml冰醋酸冰醋酸11.5ml水水28.5ml配制成的溶液配制成的溶液含含3mol/L钾盐、钾盐、5mol/L醋酸醋酸（pH4.8）。

4.胰胰RNA酶酶：

将胰：

将胰RNA酶（酶（RNA酶酶A）溶于）溶于10mmol/LTris.Cl（pH7.5）、15mmol/LNaCl中，中，配成配成10mg/ml的浓度，于的浓度，于100加热加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于份保存于-20。

5.氯仿，乙醇氯仿，乙醇，70%乙醇乙醇。

（二）实验步骤

（二）实验步骤1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液液体培养基（含体培养基（含Amp0.1mg/ml）中，中，37振荡培养振荡培养过夜。

过夜。

2.将菌液倒入将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，管中，10,000rpm离心离心1min，去掉上清液，重复去掉上清液，重复两次两次。

3.沉淀悬于沉淀悬于200LSolutionI中中,涡旋使涡旋使充分充分悬浮悬浮。

4.加入加入300LSolutionII，混，混匀（注意匀（注意动作轻动作轻），冰箱，冰箱3放置放置5min。

5.加入加入300LSolutionIII,混匀（注意混匀（注意动作轻动作轻），冰箱，冰箱3放置放置5min。

6.12,000rpm，离心离心5min，将上清移至将上清移至1个新个新Eppendorf管中，注意所取体积（约管中，注意所取体积（约600L）。

7.加入加入等体积氯仿等体积氯仿（约（约600L），），混匀混匀（注（注意动作轻）。

意动作轻）。

12,000rpm，4，离心离心10min，取取上清上清液。

液。

8.上清液上清液中加入中加入预冷的等体积异丙醇预冷的等体积异丙醇，-20沉淀沉淀2030min。

9.12,000rpm离心离心15min。

10.去上清，去上清，沉淀沉淀加入加入500L70%乙醇乙醇洗涤洗涤2次次（12,000rpm离心离心3分钟）。

分钟）。

11.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥真空干燥沉淀。

沉淀。

12.每管中加入每管中加入25L无菌水无菌水1LRNase，37溶解质粒溶解质粒DNA。

（三三）实验结果及讨论实验结果及讨论碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，取方法之一，提取量较大，便于操作提取量较大，便于操作。

如有如有蛋白质残留蛋白质残留，干燥后，干燥后不透明不透明，而呈，而呈白色白色。

附附II：

B型质粒小样快速提取试剂盒型质粒小样快速提取试剂盒北京博大泰克（北京博大泰克（BioDev）生物基因技术有限责任公司）生物基因技术有限责任公司（一一）概述概述采