碱性成纤维细胞生长因子在鼠缺血心肌中表达及其促血管新生作用.docx

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碱性成纤维细胞生长因子在鼠缺血心肌中表达及其促血管新生作用

碱性成纤维细胞生长因子在鼠缺血心肌中表达及其促血管新生作用

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作者：

盛娓娓黄晶周大燕李文章【摘要】目的探讨腺病毒穿梭质粒介导的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因质粒在大鼠缺血心肌中的表达情况及其对缺血心肌血管新生、梗死面积的影响。

方法42只健康SD大鼠接受冠状动脉左前降支结扎术，存活30只，随后随机分为治疗组（n=15）和对照组（n=15），治疗组于心肌梗死区和正常区交界处局部注射100μlbFGF基因（1μg/μl），对照组以等体积生理盐水处理。

4w后观察红色荧光蛋白（RFP）和bFGF表达情况。

微血管计数和氯化三苯四氮唑（TTC）分别检测血管新生情况和梗死面积。

结果①基因转染后4w的心肌冰冻切片中均可见RFP表达;治疗组心肌组织bFGFmRNA表达水平较对照组明显增高〔1.238±0.323vs0.771±0.102（P0.05）〕,仅在治疗组检测到bFGF蛋白表达。

②治疗组微血管密度明显高于对照组〔141.13±17.65vs75.58±6.59/视野（P0.05）〕;治疗组梗死面积小于对照组〔16.32±0.43vs17.00±0.57%（P0.05）〕。

结论重组bFGF裸质粒经心肌内直接注射后能有效表达并发挥促进梗死后心肌血管新生和缩小梗死面积的作用。

【关键词】基因转染;心肌梗死;血管新生　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionofbasicfibrolastgrowthfactor（bFGF）cDNAmediatedbyadenovirusshuttleplasmidinischemicmyocardiumandobservetheimpactonangiogenesisandmyocardialinfarctarea.MethodsTheanteriordescendingcoronaryarterywasligatedtomakeacutemyocardialinfarctionmodels.42healthSDratsacceptedoperationand30ratssurvived.Thesurvivalratsweredividedintocontrolgroup（n=15）andtreatmentgroup（n=15）randomly.Avolumeof100μl（1μg/μl）pAdTracebFGForphysiologicalsalinewasinjecteddirectlyintothejunctionalzone.After4weeks,theexpressionofRFPwasdetectedbyfluorescencemicroscope.TheexpressionofbFGFgenewasevaluatedbyRTPCRandwesternblot.Myocadialcapillarycountswerecalculatedtoevaluatedtheproangiogenceffect.SlicesoftheLVwerestainedwithtriphenyltetrazoliumchloridetodelineatemyocardialinfarctarea.ResultsAfter4weeks,allanimalswithgenetherapycandetecttheexpressionofRFP.TheexpressionlevelofbFGFmRNAwashigherinthetreatmentgroup（1.238±0.323vs0.771±0.102,P0.05）,theexpressionofbFGFproteincoulddetectedonlyinthetreatmentgroup.Comparedtothecontrolgroup,thecapillarydensitywashigherinthetreatmentgroup（141.13±17.65vs75.58±6.59,P0.05）.Themyocardialinfarctionareaofthetreatmentgroupwassmallerthanthecontrolgroup〔（16.32±0.43）%vs（17.00±0.57）%,P0.05〕.ConclusionsbFGFgenemediatedbyadenovirusshuttleplasmidcanbeefficientlytransferredintoratischemicheartandthenstimulateangiogenesisandminimizemyocardialinfarctarea.　　【Keywords】Genetransfection;Myocardialinfarction;Angiogenesis　治疗性血管新生通过上调血管生长的细胞因子或受体，从而促进新的小血管生长，建立有效供血的侧支循环，达到恢复缺血心肌血供、改善症状和预后的目的，虽然动物实验取得一定的成效，但临床试验效果不容乐观，可能与经外周静脉途径输入后，到达缺血心肌局部的因子浓度较低有关。

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种强效的促血管生成物质，具有促进内皮细胞、平滑肌细胞和纤维母细胞分裂、增殖和分化，并使出生后早期冠脉血管系统发育成正常的血管树〔1〕。

本研究采用心肌内注射的方式，将重组bFGF输送至缺血心肌局部，以增加局部组织中治疗基因的浓度，提高bFGF基因的表达，促进其促血管新生效应的发挥。

本实验所用重组质粒同时含有标记蛋白红色荧光蛋白（RFP），可直观检测基因表达是否成功。

　　1材料与方法　　1.1动物健康SD大鼠42只，雌雄不限，体重160～220g，购于重庆医科大学实验动物中心。

　　1.2主要仪器与试剂PCR仪（BioRad）;电泳仪（BioRad）;大量质粒抽提试剂盒（QIAGEN）;兔多克隆Ⅷ因子抗体（嘉美公司）;即用型Envision试剂（Dako）;2，3，5三苯基氯化四氮唑（TTC，Sigma）;兔抗人bFGF（SantaCruz），鼠βactin内参抗体（嘉美）;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、山羊抗大鼠IgG（Chemicom）;二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒（博麦德）;逆转录cDNA合成试剂盒（fermatas）。

　　1.3重组bFGF质粒的构建、扩增及鉴定表达24kD蛋白质的bFGF基因编码区通过PCR扩增后亚克隆至pAdTraceTO4，酶切位点为BamHⅠ和SalⅠ（本部分由美国芝加哥大学医学中心构建）。

将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆进行质粒扩增抽提，通过EcorⅠ酶切鉴定和基因测序证明pAdTracebFGF质粒构建成功。

见图1。

　　图1pAdTracebFGF基因测序部分片段　　1.4鼠急性心肌梗死模型建立和心肌内注射随机选取大鼠，称重，麻醉完全后将动物平卧固定，脱毛，消毒铺巾，气管插管，呼吸机辅助呼吸，于左前外侧切口，纵行剪开心包，暴露心脏，以左冠状静脉为标志，于左心耳后根部下方2mm处进针，以60prolene穿过心肌表层，予以结扎。

观察到部分前壁心肌变灰白，心电图示ST段抬高视为制模成功，将制模成功的大鼠（共30只）随机分为基因治疗组和对照组，每组各15只。

基因治疗组用微量注射针在左室前壁梗死区和正常区交界处选择三点注射重组bFGF100μl（1μg/μl），对照组于相同部位选择三点注射等量生理盐水。

注射完毕后逐层关胸，待实验动物恢复自主呼吸后观察30min，呼吸循环稳定后拨出气管插管。

继续喂养动物4w。

　　1.5观察指标　　1.5.1观察RFP表达饲养4w后处死动物，取出心脏，剪除双侧心房及右心室，沿左室长轴自心尖至心底做2mm薄片，取部分组织制作冰冻切片，于荧光显微镜下观察红色荧光表达。

　　1.5.2梗死后心肌病理形态取组织于4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、苏木精伊红染色，镜下初步观察心肌梗死区病理组织学表现。

　　1.5.3心肌梗死面积计算对照组和治疗组各取5只动物剔除心外膜，将左心室平行房室沟从心底到心尖切成厚约3mm环4～5块，置于1%TTC溶液中，37℃水浴20～30min。

存活心肌为砖红色，梗死心肌淡黄色，分别剪下称重，以梗死心肌重量与左室总重量百分比为梗死面积。

　　1.5.4FⅧRag免疫组化染色及微血管计数采用二步法，即先加Ⅷ因子多克隆抗体，再加通用型二抗，DAB显色，显微镜下控制反应时间在2～5min，自来水冲洗，苏木素复染、中性树胶封片。

内皮细胞经染色后呈棕色。

每张切片随机取3个400倍视野，计算每个视野内毛细血管的数目，取平均值即为毛细血管密度。

　　1.5.5RTPCR检测bFGFmRNA的表达Trizol试剂提取总RNA，按逆转录cDNA合成试剂盒说明书合成bFGFcDNA。

使用Premier5.0软件设计引物，人bFGF基因序列来自NCBI基因库：

上游引物5′CCTGGCTATGAAGGAAGATG3′;下游5′CGTTTCAGTGCCACATACC3′，片段长度为141bp。

内参大鼠βactin引物为：

上游引物：

5′AGGGAAATCGTGCGTGAC3′，下游引物：

5′TGGAAGGTGGACAGTGAG3′，片段长度为443bp。

　　PCR反应条件为：

94℃预变性3min后行30个循环，每循环94℃30s，55℃30s，72℃1min，循环结束后72℃延伸5min。

2%琼脂糖凝胶电泳分析，拍照，再经图像分析系统进行扫描分析，得出电泳条带的光密度值，据内参扩增条带与bFGF扩增条带的光密度比值推断mRNA相对含量。

　　1.5.6Western印迹检测bFGF蛋白的表达SDSPAGE凝胶电泳分离心肌蛋白，半干法转移蛋白至物理气相沉积（PVD）膜。

以含5%脱脂奶粉的TBST液封闭膜，一抗（1∶1000）孵育4℃过夜。

膜经TBST洗涤后二抗室温孵育1h，一抗为兔bFGF多克隆抗体和鼠βactin内参抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、抗大鼠IgG。

ECL化学发光系统检测蛋白条带。

　　1.6统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件，组间进行两独立样本均数的t检验。

　　2结果　　2.1RFP表达基因治疗组心肌组织冰冻切片均检测到RFP的表达，而对照组未检测到RFP的表达。

见图2。

　　图2RFP表达（×400）　　2.2心肌梗死区域病理学观察心梗组织HE染色可见对照组梗死区心肌细胞溶解消失及空泡样变性，代之以瘢痕纤维组织，心肌细胞肿胀，胞核溶解消失;新生血管少或不明显。

而治疗组梗死区病理结构跟对照组相似，纤维增生相对较少，并夹杂有少量新生血管。

见图3。

　　图3梗死区心肌病理学观察（HE，×400）　　2.3重组bFGF治疗对梗死面积的影响见图4。

治疗组梗死面积明显小于对照组，两组梗死面积分别为（16.32±0.43）和（17.00±0.57）%，差异显著（P0.05）。

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