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基本步骤。

　　Abstract:

fromseveralaspectssuchastheprinciple，basicstepsandadvantagesanddisadvantagesofagrobacteriummediatedmethod，genemarksmanship，ultrasoundmediatedmethod，ovaryinjectionsandthemethodofpollentubechannelsfivekindsofplanttransgenictechnologyincommonusearebrieflyintroduced.

　　Keywords:

agrobacteriummediatedmethod;

Genemarksmanship.Ovaryinjections;

Pollentubechannel;

Theprinciple;

Basicsteps.

　　植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。

世界上第一种转基因植物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年培育成功。

世界上第一种转基因食品是1993年投放美国市场的转基因晚熟西红柿。

转基因农作物可能同时具有高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等多重优点，因此中国科学院院士、华中农业大学教授张启发曾指出：

"

农业转基因技术可保障农业的可持续发展，是解决世界温饱问题的根本途径。

　　植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。

通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。

以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。

植物转基因技术已应用到玉米、水稻、麦、大豆和棉花等许多农作物。

同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中。

　　目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类:

以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法;

以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法;

以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法[1]。

由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握;

原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长;

相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用[2]。

本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优点。

　　1农杆菌介导法

　　1.1农杆菌转化的基本原理

　　农杆菌是一种天然的基因转化系统.农杆菌分为根瘤农杆菌和发根农杆菌.根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导质粒（Ti），其上含有可转DNA（T-DNA）区、毒性区（Vir区）以及冠瘿碱代谢基因编码区.T-DNA两端是两个25bp的重复序列，分别称为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因.Vir区中含有多个基因段，如VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH等，每个基因段都含有多个基因.当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，如乙酰丁香酮等，这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因（chvA、chvB等）介导的催化作用促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面;

另一方面则被Ti质粒上由VirA和VirG组成的双组分调节系统识别，从而诱导其他Vir基因的表达.VirD1和VirD2共同作用，由T-DNA右边界开始向左边界切割产生一条T-DNA单链（T-链），T-链5&

#39;

末端与一分子VirD2结合，其余部分与VirE2结合，组成T-复合体.T-复合体被转移到农杆菌外，通过植物细胞壁上VirB蛋白组成的通道进入到植物细胞内.VirD2和VirE2上的核定位信号被转运蛋白识别，经主动运输过程通过核孔进入细胞核内，在VirD2的帮助下，入植物核染色体中，完成T-DNA由农杆菌向植物的转移及整合过程[3].

　　1.2农杆菌介导法的基本步骤

（1）诱导目标植物外植体;

（2）构建含有目的基因的质粒;

（3）质粒导入合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程;

（4）植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染;

（5）共培养及脱菌处理;

（6）愈伤组织筛选、分化与植株再生;

（7）再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测;

（7）转基因T1代的目标性状鉴定[4，5]。

　　1.3农杆菌介导的转化技术与其他方法相比，具有十分明品的优点

　　1.农杆菌Ti质粒基因转化系统足H前研究最多、理论机理最清楚，技术方法最成熟、应用最广泛的趣因转化途校。

2.利用天然的转化载体系统，转化频率高，转化效果好。

3.能导入大片段的DNA。

4.外源基闲多以单拷贝插入，较少出现IP基化和基因沉默现象，遗传稳定性好，且多数符合盂德尔遗传规律。

农杆菌介导法的缺点足需要建立植株再生体系，并需要经历繁琐的原生质体或组织培养过[6]。

2基因枪法

　　2.1基因枪法的原理

　　利用基因枪产生的高压动力冲击波将包裹外源DNA的重金属颗粒（如钨粉、金粉等）射穿植物细胞壁和细胞膜，射入植物细胞，使外源DNA随机整合到植物细胞染色体中，达到使外源DNA在受体植物中正常表达和稳定遗传的目的[7]。

　　2.2基因枪法的基本步骤

（1）诱导目标植物外植体;

（2）构建含有目的基因的质粒或制备外源DNA样品;

（3）重金属颗粒的外源基因包被过程;

（4）植物愈伤组织的前处理;

（5）基因枪轰击过程;

（7）再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测[8]

　　2.3基因枪法的优点所在

　　小麦遗传转化中使用最广泛的一种方法，它没有宿主的限制、具有广泛的祀受体类型、操作简便快捷、可控度高等优点。

该技术可用植物组织、愈伤组织、悬浮细胞系和胚作为遗传转化的受体材料，从而避开了从植物原生质体再生植株的难题，又解决了农杆菌的宿主范围限制的问题[9]。

作为基因枪转化的受体，不同的研究者有不同的选择，采用胚性愈伤组织、幼胚、幼穗等作为受体进行转化均有获得成功的报道。

　　3花粉管通道法

　　20世纪70年代末期，在DNA片段杂交假设理论和对植物开花受精过程的解剖学及细胞学特征研究的基础上，我国科学家周光宇[10]等推测外源DNA可以通过花粉管经过的珠心通道进入受精胚囊，转化进入精卵融合细胞、早期合子及早期胚细胞。

随后，周光宇等创建花粉管通道技术并通过该技术将外源DNA导入陆地棉，成功地培育出抗枯萎病的新品种[11]。

目前，花粉管通道法已成功应用于棉花、水稻、小麦，大豆等农作物的改良和育种工作。

　　3.1花粉管通道法的原理

　　在植物授粉后的特定时期内，利用精卵融合细胞、早期合子及早期胚细胞无细胞壁和核膜结构的特点，以柱头内形成的花粉管为通道，将外源DNA导入受精胚囊。

在受精后细胞基因组合成和复制活跃的条件下，将外源DNA随机整合到受体植株基因组上

　　3.2花粉管通道法的基本步骤

（1）目的基因的制备;

（2）根据受体植物受精后，花粉管形成的情况和精卵细胞融合的时间，确定最佳时间，进行外源DNA导入;

（3）转化种子及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测[12]。

　　3.3花粉管通道法的优点

　　操作简单;

对受体植物无种类的要求;

对外源DNA无特别要求;

无组织培养过程;

转化速度较快，育种周期短等。

其缺点是:

该方法的具体机制不清，且缺乏分子生物学证据;

受自然条件、环境条件及受体植物的花期等生理条件限制;

该方法要求充分了解受体植物开花受精的时间;

该方法要求很强的经验性，对某些农作物的操作难度较大;

转化率低;

结果的可重复性差;

在转基因植株的后代中，外源基因的稳定遗传性差[13]

　　4超声波介导法

　　作为一种新创建的物理学基因转化方法，超声波介导法已被用于真核生物的基因转化研究和人类基因治疗领域。

在农作物基因转化研究中，超声波介导法已成功地将外源DNA转导入烟草和甜菜的原生质体、玉米和小麦的未成熟胚及烟草的叶片中。

目前，该方法常与农杆菌介导法共用以提高外源DNA的转化效率[14]。

超声波介导法的原理是:

利用超声波的空化作用，在细胞膜上产生可恢复的渗透孔空洞，从而使外源DNA进入细胞。

　　4.1超声波介导法的基本步骤

（1）目标植物外植体的制备;

（2）目的基因的制备;

（3）超声波处理;

（4）转化受体俞伤组织的筛选与植株再生;

（5）再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。

超声波介导法的优点有:

该方法不受宿主范围的限制，可以将外源基因导入任何基因型的植物细胞内;

该方法可以避免对细胞的机械性损伤有利于原生质体的存

　　4.2超声波介导法的优点

　　该方法不受宿主范围的限制，可以将外源基因导入任何基因型的植物细胞内;

该方法可以避免对细胞的机械性损伤，有利于原生质体的存活;

该方法操作简便、设备便宜等优点。

由于超声波介导法也存在外源DNA随机整合及外源DNA拷贝数多等问题。

因此，该方法也会导致转基因后代的突变率提高、整合的DNA丢失及基因沉默等现象。

　　5子房注射法

　　子房注射法是一种育种工作中经常使用的简便易行的植物转基因方法。

1993年，丁群星及其同事首次使用子房注射法将Bt基因导入玉米子粒中并成功获得了具有一定玉米螟抗性的转基因玉米。

目前，子房注射法成功用于玉米、小麦、甜瓜和南瓜[15]等农作物的转基因育种工作中。

　　5.1子房注射法的原理

　　使用微注射针或显微注射仪将外源DNA注入处于减数分裂期的受体植物的子房中，借助子房产生的压力和卵细胞产生的吸收力，外源DNA进入受精的卵细胞中，借助合子胚旺盛分裂过程中基因组的复制、重组、缺失或易位等现象，外源DNA被随机整合到受体染色体上[16]。

　　5.2子房注射法的基本步骤

（2）根据受体植物受精后其子房的变化特点，确定最佳时间，进行外源DNA注射或将离体的受精子房进行外源DNA注射，再对该离体子房进行培养;

（3）转化种子及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。

　　子房注射法的优点:

该方法无需组织培养过程，因此实验过程简单，操作便捷;

该方