细胞固定化综述及实验报告Word下载.docx
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细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍。
1.2固定化细胞的特性⑵
1.2.1形态学特征
固定化细胞多为球形颗粒，但也有制成立方块或膜状的。
用吸附法时，则取决于吸附物质的形状。
在球形固定凝胶内，细胞的分布并不均匀，而是接近于球的外表面。
有
时细胞会在凝胶内的小泡中繁殖，直到最后充满整个可利用的空间。
1.2.2生理学特征
固定化细胞必需具有生命活力，因此创造良好的细胞载体或基质，选择恰当的固定化方法和生物反应器，最佳的反应溶液和周围微环境，维持细胞适度的生长和繁殖等尤为重要。
如果生长繁殖过度，容易使细胞泄漏出来，增加扩散障碍。
破坏固定细胞的载体或基质。
123理化环境特征
固定化细胞的微环境对固定化细胞活力的发挥有很大的影响。
如丙乙烯醇已经用于降低固定化细胞内水的活度，水的吸附程度并影响微生物细胞的吸附。
固定化细胞的呼吸生长速度、扩散速率以及代谢作用等。
124生物膜的动力特征
研究结果表明，微生物细胞首先吸引到物体表面，继而分泌出黏性高分子物质，将细胞牢固地黏附在物体表面上。
此后，继续由微生物细胞分泌一些化合物，逐渐形成微生物膜。
2实验方案
2.1实验目的
2.1.1理解固定化细胞技术的原理方法和意义。
2.1.2掌握用海藻酸钠制备固定化酵母细胞的方法。
2.1.3掌握用斐林试剂比色法测定还原糖的方法。
2.2实验原理
2.2.1细胞固定化原理
固定微生物细胞的原理是将微生物细胞利用物理的或化学的方法，使细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持微生物的活性。
它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。
由于微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使微生物活性不变。
细胞固定化的方法有多种，如吸附法、载体偶联法和包埋法等。
工业上常用包埋法固定微生物细胞。
本次实验采用包埋法对酵母进行固定。
1、包埋法
指将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出而底物和产物可以进入和渗出。
细胞和载体不起任何结合反应，细胞处于最佳生理状态。
因此，酶的稳定性高，活力持久，所以目前对于微生物细胞的固定化大多采用包埋法。
2、海藻酸钙凝胶固定酵母细胞
根据包埋剂的特性，可以分为海藻酸钙凝胶包埋法、角叉菜胶包埋法、聚丙烯酰胺凝胶包埋法。
本次实验中，我们选用海藻酸钠和氯化钙制成的海藻酸钙凝胶来进行酵母细胞的固定化。
如在海藻酸钠呈溶液状时，将细胞加入混匀，然后在氯化钙中凝固形成海藻酸钙凝胶，凝胶颗粒中的微小空格将酵母细胞固定。
海藻酸钙凝固的颗粒能反复使用，细胞在空格中可以新陈代谢（固定活细胞），也可利用细胞中的酶进行酶促反应（固定死细
222使用斐林试剂测定还原糖的原理
生物组织中普遍存在的还原糖种类较多•常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖。
它们的分子内都含有还原性基团（游离醛基或游离酮基），因此叫做还原糖。
用斐林试剂能检验生物组织中还原糖存在。
斐林试剂由甲液（质量浓度为0.1g/mL的
NaOH溶液）和乙液（质量浓度为0.05g/mL的CuSO4溶液）配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu（OH）2沉淀。
Cu（OH）2与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成砖红色的
CU2O沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。
其反应式如下:
OO
R—C—H+2Cu（OH>
i—R—C—OH+CujOl
《蓝色》（薛红色J
用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化过程为：
浅蓝色—棕色—砖红色（沉淀）本实验选用海藻酸钙凝胶固定化酵母细胞，并检测其对葡萄糖的消耗效率。
2.3实验方案的确定
2.3.1菌种（酵母菌）的来源
1、采用常规的土壤微生物分离方法，从果园土壤中筛选出酵母菌或者使用实验室保存的酵母菌。
2、从活化培养平板上，挑取单（酵母）菌落，用于接种到培养液中。
2.3.2选择的土壤悬液浓度
由于果园中的土地非常湿润，而且通风状态良好，可以估计土壤里面的微生物种类较多，含量也很丰富。
所以，为了确保培养得到的微生物菌落不会过密或过于稀疏，在本次实验中，选择了3个土壤悬液浓度梯度，分别是：
X10-4、X10-5、X10-6。
2.3.3筛选酵母菌的培养基（液）
常用于筛选分离土壤中的酵母菌的培养基有：
YPD培养基和马铃薯葡萄糖培养基,
由于YPD培养基的配置方便，而且也常用于酵母菌的发酵培养，所以本次实验选择用
YPD培养基来筛选分离酵母菌。
YPD培养基（液）的配方见表2.1:
表2.1YPD培养基
200mL
培养基名称
成分
含量
筛选菌种
蛋白胨
4g
酵母提取物
2g
YPD培养基
葡萄糖
酵母菌
琼脂粉
蒸馏水
200mL
234选择的固定酵母细胞的方法一包埋法
据资料显示，目前工业生产中常采用的一种理想的微生物细胞固定化方法是包埋法,它与其他固定化方法相比，具有不与蛋白氨基酸残基反应、很少改变细胞结构的优点，而且细胞回收率高。
2.3.5包埋法选择的凝胶一海藻酸钙凝胶
而各种包埋法所采用的凝胶又具有以下优缺点：
表2.2包埋剂的分类
凝胶名称
分类
包埋条件
细胞活性
强度
天然凝胶
琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶
温和
不变
差
合成凝胶
聚丙烯酰胺、光交联树脂
聚合反应
部分失活
高
因为海藻酸钙和氯化钙在实验室中容易获得，而且成本相对其他固定化方法来说较低。
同时，海藻酸钙凝胶的反应条件较温和，回收的细胞活力高，故在本次实验中，选择海藻酸钙凝胶包埋法来固定酵母细胞。
2.3.6斐林试剂
斐林试剂是常用的一种试剂，它的作用主要是用来检验是否有还原性糖的存在，以区别还原性糖和非还原糖。
斐林试剂由甲液（质量浓度为0.1g/mL的NaOH溶液）和乙液（质量浓度为0.05g/mL的CuSO4溶液）配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu（OH）2沉淀。
当把斐林试剂加入到待测液中，试剂中浅蓝色的Cu（OH）2,沉淀能与还原糖在加热条件下生成砖红色的CU20沉淀，而还原糖本身被氧化。
2.4实验材料及仪器
241常用玻璃器具
三角瓶、玻璃棒、试管、培养皿、玻璃珠、烧杯、、容量瓶、量筒、酒精灯。
2.4.2实验材料及试剂
1、YPD酵母培养基
2、海藻酸钠固体
3、5%CaCl2溶液：
称取25g氯化钙，加入无菌水配制成500mL的氯化钙溶液，加入HCI调节溶液至适合酵母生长的pH（3.8-6.0）。
4、无菌蒸馏水
5、
（1）斐林试剂A液：
40gCuSd.5H2O溶解于蒸馏水并定容至1L。
（2）斐林试剂B液:
200g酉石酸钾钠（KNaC4H4O6.5H2O）与150gNaOH溶于蒸馏水中，并定容至1L0
（3）斐林试剂A、B分别贮存，使用前等体积混合。
6、0.1%葡萄糖标准液：
取80C下烘至恒重的葡萄糖0.1000g,加蒸馏水溶解，定容至100mLo
2.4.3实验仪器
移液枪、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、接种环、37C恒温培养箱、恒
温振荡摇床、恒温水浴锅、分光光度计、离心机。
2.5.4YPD培养基（200mL）
按照配YPD培养基的配方来配制、调节pH、加入琼脂，然后分装到250mL三角瓶中，并用密室的报纸包扎好瓶口，贴上相应的标签。
灭菌后，将培养基倒入到培养皿中制成YPD平板。
YPD液体培养基不需要加入琼脂。
2.4.5试剂用量表
具体海藻酸钠的用量、溶解海藻酸钠所需无菌去离子水的总量，以及酵母菌悬液的
用量等情况如表2.3。
其中，酵母菌细胞悬液的接种量为发酵培养液体积的5%,即每
200mL发酵液中，所接种的酵母菌悬液总量为：
200mL5-10mL
表2.3固定化过程各成分用量表
实验号
ag
BmL
CmL
DC
EmL
1
6.2
180
20
100
2
2.6
3
12.9
4
1.2
空白（对照组）
一
10
其中：
A—海薛酸钠的质量（g）;
B—溶解海藻酸钠所需无菌去离子水的总量（mL）；
C—醉母菌悬液的量（mL）;
D—氯化钙溶液的温度CC）；
E—吸取海藻酸钠与酵毋菌悬液混合物的量（约总量1/2,mL）。
2.5实验流程图
图2.1实验流程图
2.6实验步骤
261制备土壤悬液
1、土壤样品采集
选定采土地点后，铲去表土层2〜3cm,取3〜10cm深层土壤10g,装入已干净的塑料袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
2、土壤稀释液
从已经采样回来的土壤中，称取5g土壤，在火焰旁放入装有45mL无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中的菌体、芽胞或抱子分散，制成稀释度为10-1的土壤悬液，
然后再逐步稀释成浓度为10-4、10-5、10-6的土壤稀释液。
2.6.2酵母菌的分离筛选
1、分离
用移液枪取稀释度为10-4、10-5、10-6的土壤稀释液各100H然后分别加入到制备好的YPD培养平板上，用玻璃珠把稀释液均匀涂布在平板上，做3个平行样。
回收玻璃珠后，将平板倒置于37C恒温培养箱中培养5〜6do
2、转接纯化
恒温培养长出酵母菌的菌落后，用接种环在平板上挑取生长旺盛、较有粘性的单个酵母菌菌落，并接种到新鲜的YPD培养基平板上，并将平板倒置于37C恒温培养箱中培养，观察菌落的纯化情况。
2.6.3发酵培养
经过纯化后获得酵母菌菌落，在超净工作台上，选择表面光滑且带粘性的单菌落作为纯种，然后用接种环将各单一菌种接种于装有200mLYPD液体培养基的250mL三角瓶中，在37C恒温摇床中进行发酵培养48h,制备成酵母细胞悬液。
2.6.4海藻酸钙凝胶固定酵母
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