微生物学实验指导(8个).doc
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课程教学日历
课程名称：
微生物学（实验部分）授课学期：
2010～2011学年度第一学期
周次
实践项目和名称
学时
3
实验一培养基的制备与灭菌
3
4
实验二油镜的使用及常见细菌形态观察
3
5
实验三细菌运动性观察及革兰氏染色
3
7
实验四酵母菌、霉菌个体及菌落特征观察
3
8
实验五土壤微生物的分离与纯化
3
9
实验六霉菌孢子数量的测定
3
11
实验七温度对微生物生长的影响
3
13
实验八淀粉水解试验
3
实验一培养基的制备与灭菌
一、实验目的
1.学习和掌握培养基配制的一般方法与步骤
2.掌握高压蒸汽灭菌的原理及操作方法
3.学会制作棉塞
二、实验原理
1.培养基配制的一般原则
2.高压蒸汽灭菌原理强调温度而非压力
三、实验材料及用具
药品：
牛肉膏，蛋白胨，琼脂，氯化钠，可溶性淀粉，葡萄糖，马铃薯，硝酸钾，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸铁
用具：
试管，三角瓶，铁架台，烧杯，量杯，玻璃棒，锅，天平，药匙，PH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，纱布，线绳，高压灭菌锅
四、实验方法与步骤
称量→溶解→定容→调PH→分装→加塞→包扎→灭菌→摆斜面→无菌检查
注意强调1.琼脂等药品添加注意事项（牛肉膏，高氏一号，PDA）
2.分装时的注意事项并示范
3.灭菌加水→装料→加盖→排气→升压→保压→降压→无菌检查
五、实验演示
1.培养基分装方法
2.棉塞的制作
3.试管斜面的搁置
六、作业与思考
实验报告
分组：
牛肉膏蛋白胨培养基1500ml40斜面余三角瓶
高氏一号培养基1500ml30斜面余三角瓶
PDA培养基2000ml60斜面余三角瓶
淀粉水解培养基1000ml8斜面余三角瓶
同时灭无菌水待用“多多益善”
实验二油镜的使用及常见细菌形态观察
一、实验目的
1．掌握细菌基本形态和特殊结构的观察方法。
2．掌握光学显微镜油镜的使用和维护方法，了解荧光显微镜和暗视野显微镜的构造和使用方法。
二、实验原理
1．油镜的使用原理
图1-2显微镜油镜的使用原理
油镜的放大倍数高而透镜很小，自标本片透过的光线，因玻片和空气的折光率不同（玻璃n=1.52，空气n=1.0），部分光线经载玻片进入空气后发生折射，不能进入接物镜，致使射入光线较少，物象不清晰。
在油镜和载玻片之间滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野光亮度增强，物象清晰（见图1-2）。
三、实验材料及用具
1．示教片：
各种球菌、杆菌、弧菌、荚膜、鞭毛、芽胞的示教片。
2．器材及其他：
光学显微镜、载玻片、擦镜纸、香柏油、脱油剂等。
四、实验方法与步骤
（一）、细菌基本形态和特殊构造的观察
1．细菌的基本形态（各种球菌、杆菌、弧菌等）
观察要点：
注意细菌的染色性、相对大小、形状及排列方式。
2．特殊结构的观察（荚膜、芽胞、鞭毛）
观察要点：
注意这些特殊结构的大小、形状及其在菌体中的位置，均有助于细菌的鉴定。
（二）、光学显微镜油镜的使用
1．光学显微镜的构造
光学显微镜是观察细菌形态最常用的一种仪器，其构造分为机械部分和光学部分，机械部分包括：
镜座、镜臂、载物台、镜筒、镜头转换器、调焦装置等；光学部分包括：
接物镜、接目镜、反光镜、聚光器、光圈等（见图1-1）。
图1-1光学显微镜的构造
显微镜的接物镜有低倍镜、高倍镜、油镜三种，放大倍数依次增高，其识别方法为：
（1）低倍镜：
镜头标志为10×或10/0.25，镜头最短，其上常刻有黄色环圈。
（2）高倍镜：
镜头标志为40×或40/0.65，镜头较长，其上常刻有蓝色环圈。
（3）油镜：
镜头标志为100×或100/1.30，镜头最长，其上常刻有白色环圈，或“oil”字样。
2．使用方法
（1）采光：
使用显微镜时必须端坐，将显微镜放在胸前适当位置。
将低倍镜转到中央并对准下面的聚光器，打开光圈，转动反光镜，使光线集中于聚光器（以灯光为光源时，使用凹面反光镜，以自然光为光源时用平面反光镜）。
根据所观察的标本，通过升降聚光器和缩放光圈以获得最佳光度。
当用低倍镜或高倍镜观察时，应适当缩小光圈，下降聚光器；当用油镜观察时，光线宜强，应把光圈完全打开，并将聚光器上升到最高位置。
（2）低倍镜调焦：
将欲观察的标本置载物台上，用弹簧夹和推进器固定，将待检部位移至视野正中央，上升载物台至不能升高为止。
用左眼观察接目镜，缓慢调节粗调节器，使载物台下降，待看到模糊的图像时，再调节细调节器，直至看到清晰的图像为止。
（3）油镜的使用：
低倍镜找到物象并调至清晰之后，转开物镜头，在玻片的标本上滴加1滴香柏油，将油镜头转换至中央，缓慢调节粗调节器，使镜头浸入油中，当油镜头几乎接触玻片时停止转动（从侧面观察），边观察接目镜边轻轻转动粗调节器（此时只能上升镜头，不能下降，防止压坏玻片及损坏物镜），待看到模糊物象时改调细调节器，直至找到清晰物象。
镜检时应将标本按一定方向呈“弓”形移动，直至整个标本观察完毕，以防漏检。
观察时应将两只眼睛同时睁开，左眼观察，右眼用于绘图或记录。
标本观察完毕后，先将物镜头移开，再转动粗调节器使载物台下降，取下载玻片，立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净。
4．注意事项
（1）显微镜是精密光学仪器，在搬放时应右手紧握镜臂，左手稳托镜座，平端在胸前，轻拿轻放。
（2）显微镜放到实验台上时，先放镜座的一端，再将镜座全部放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震动过大，透镜和微调节器的装置易损坏。
（3）避免强酸、强碱、氯仿、乙醚、酒精等化学药品与显微镜接触，避免日光直射，显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。
（4）接目镜和接物镜不要随便卸下，必须抽取接目镜时，须将镜筒上口用布遮盖，避免灰尘落入镜筒内。
更换接物镜时，卸下后应倒置在清洁的台面上，并随即装入木箱的置放接物镜的管内。
（5）细调节器是显微镜最精细而脆弱的部分，不要向一个方向连续转动数周，应轻微地来回旋转。
（6）镜头必须保持清洁，油镜使用完后应立即用擦镜纸拭去香柏油。
若油镜镜头上的油迹未擦干净，应先将1:
1醇醚混合液或二甲苯滴在擦镜纸上擦拭镜头，再用干净擦镜纸将镜头上残留的醇醚混合液或二甲苯擦净。
（7）显微镜擦净后，取下标本片，下降聚光器，再将物镜转成“品”字形，送至显微镜室放入镜箱内。
五、作业与思考
1.实验报告
实验三细菌运动性观察及革兰氏染色
一、实验目的
1.学会制作水浸片观察细菌运动性（压滴法）
2.掌握革兰氏染色步骤
3.初步掌握无菌操作技术
二、实验原理
1.革兰氏染色的原理
三、实验材料及用具
E.coli，金黄色葡萄球菌（培养8-24小时）各6支，载玻片，盖玻片，显
微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，无菌水，接种环，酒精灯，火柴，吸水纸，
革兰氏染色液
四、实验方法与步骤
1.细菌运动性观察
制水浸片→低倍镜→高倍镜→油镜→清理→还原强调各步注意
事项清理步骤
2.革兰氏染色
a.制片
涤菌（混合）→干燥→固定（过火）
b.染色
结晶紫初染1分钟→水洗→碘液媒染1分钟→水洗→95%酒精脱色30
秒-1分钟→水洗→沙红复染1分钟→水洗→干燥→镜检
强调各步注意事项
制片水滴要小，过火不等于烧，染色是混合片，菌量适当，时间合适。
关
键步骤是脱色
五、实验演示无菌操作技术
六、作业与思考
1.实验报告
2.绘E.coli，金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果图
实验四酵母菌、霉菌个体及菌落特征观察
一、实验目的
1.学习酵母菌，霉菌形态观察方法
2.了解并掌握酵母菌，根霉，曲霉，青霉的形态特征
二、实验原理（略）
三、实验材料及用具
酵母菌（培养48小时），根霉，曲霉，青霉（培养3-5天）各6皿，载玻片，
盖玻片，显微镜，无菌水，接种环，酒精灯，火柴，透明胶带
四、实验方法与步骤
1.菌落特征观察
2.个体形态观察
酵母菌挑取法水浸片
霉菌透明胶带粘贴法
酵母菌：
形态，假菌丝，厚垣孢子，出芽情况
根霉：
菌丝无隔，葡萄菌丝，假根，包囊梗，孢子囊，包囊孢子
曲霉：
菌丝有隔，足细胞，顶囊，分生孢子梗掌状分支，串生分生孢子
青霉：
菌丝有隔，无足细胞，无顶囊，分生孢子梗扫帚状
分生孢子串生单轮生，双轮生，多轮生
对称，不对称
五、作业与思考
1.实验报告
2.绘酵母菌，根霉，曲霉，青霉个体形态图
实验五土壤微生物的分离与纯化
一、实验目的
1.学习和掌握从土壤中分离纯化微生物的方法
涂布平板法，倒平板法，划线法
2.巩固无菌操作技术
3.学会制平板，包培养皿
二、实验原理
不同微生物要求营养条件不同，选用不同培养基对土壤中细菌，放线菌，霉菌进行分离，并通过加入一些物质制成选择培养基而达到分离的目的
三、实验材料及用具
土壤，灭菌的三角瓶，移液管，试管，培养皿，酒精灯，火柴，无菌水，涂布器，培养箱，接种环，培养基，链霉素，10%酚，斜面，电热炉
四、实验方法与步骤
1.土壤的制备
称土样10g→90ml无菌水中→于三角瓶中振荡20分钟，分别稀释10-210-3，10-4，10-5几个浓度于试管中，加9ml无菌水
2.制平板
溶培养基→冷却45℃左右→倒平板PDA+链霉素高氏一号+10%酚
3.涂布平板分离
取0.2ml土悬液→平板→涂布→培养细菌30℃1-2天，放线菌，霉菌25℃5-7天
4.纯化
平板划线法纯化细菌，放线菌
制平板→划线→培养
点接法纯化霉菌
制平板→点接→培养
5.转管
五、实验演示
1.无菌操作制平板
2.培养皿的包法
六、作业与思考实验报告
实验六霉菌孢子数量的测定
一、实验目的
1．明确血细胞计数板计数的原理。
2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
二．实验原理
血球计数板的构造原理：
血球计数板是一块特制的厚的载玻片，其上由四条竖槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短的横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格为计数室。
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I
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升级会员 