植物多靶点CRISPR-Cas9载体使用方法-5-1_精品文档.doc

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CRISPR/Cas9-basedgenomeeditingtechnology

ArobustCRISPR/Cas9vectorsystemformultiplextargetingofgenomicsitesinmonocotanddicotplants

亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室

华南农业大学生命科学学院

刘耀光课题组

（ygliu@）

1.pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍

CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。

CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guideRNA（sgRNA）以及由sgRNA引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs），TALENs更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。

我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。

本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点BsaI位于靠近双元载体RB位置。

sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和PCR方法拼装好，再利用GoldenGate或GibsonAssembly克隆方法组装到双元载体上。

本载体系统已经发表（Maetal.,2015,MolecularPlant,DOI:

10.1016/j.molp.2015.04.007）。

Figure1.AworkingmodeloftheCRISPR/Cas9system.TheCas9-sgRNAcomplexlocatestothetargetsitetocleavetheDNAtoproducedoublestrandbreak（DSB）.

2．CRISPR/Cas9载体与sgRNA载体图谱

2.1CRISPR/Cas9双元载体

本套载体系统的双元载体骨架为pCAMBIA-1300（ACCESSION:

AF234296），Cas9p为本实验室设计合成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征（Figure2）。

这些质粒在E.coliTOP10F’（LacIq）菌株繁殖，该菌株LacIq基因型产生的阻碍蛋白可抑制ccdB大肠杆菌致死基因的表达。

我们对pYLCRISPR/Cas9载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表1。

pYLCRISPR/Cas9Pubi-H,-B载体中的Cas9p用PUbi驱动，优选用于单子叶植物的基因打靶；对于双子叶植物，我们前期使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H在拟南芥获得了uniform简单突变（双等位突变，杂合突变，纯合突变）以及嵌合突变（Maetal.,2015）。

但是，我们最近发现用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H在拟南芥的打靶效果效率比使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H的效果效率更高，能得到更多的简单突变。

因此也推荐在双子叶植物优先使用PUbi驱动Cas9p的载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H或pYLCRISPR/Cas9P35S-B。

Figure2.ACRISPR/Cas9systemformonocotanddicotplants.

pYLCRISPR/Cas9Pubi-H,-B（above）;pYLCRISPR/Cas9P35S-H,-N,-B（below）;HPT（-H）,Bar（-B）,andNPTII（-N）encodehygromycinBphosphotransferase,PPTacetyltransferaseandneomycinphosphotransferaseII,respectively.NLS,nuclearlocalizationsequence.ThekeysequencesincludingrestrictionsitesforcloningandanalysisofsgRNAexpressioncassettesaregiven.TwoBsaI-cuttingsties[BsaI（B-L）andBsaI（B-R）]forcloningthesgRNAexpressioncassettesareseparatedbyashortenformoftheccdBnegativeselectiongene.

表一pYLCRISPR/Cas9载体新旧命名对应关系

新命名

原命名

适用植物种

植物抗性

pYLCRISPR/Cas9Pubi-H

pYLCRISPR/Cas9-MH,

pYLCRISPR/Cas9-MTmono

单子叶/双子叶

潮霉素

pYLCRISPR/Cas9Pubi-B

pYLCRISPR/Cas9-MB

单子叶/双子叶

草甘磷

pYLCRISPR/Cas9P35S-H

pYLCRISPR/Cas9-DH

双子叶

潮霉素

pYLCRISPR/Cas9P35S-B

pYLCRISPR/Cas9-DB

双子叶

草甘磷

pYLCRISPR/Cas9P35S-N

pYLCRISPR/Cas9-DN

双子叶

卡那霉素

2.2CRISPR/sgRNAvectors

sgRNA序列全长97nt，分为两部分，5’决定靶序列的20nt（seedsequence）和3’区域为保守的结构序列。

因此构建针对特定靶位点的sgRNA，只需要克隆决定靶序列的5’端20nt。

sgRNA用smallnuclear（sn）RNAU6/U3启动子驱动，以保证转录出的sgRNA停留在细胞核中与Cas9结合。

本方案用PCR扩增的方法构建包含靶序列的sgRNA表达盒，并在扩增引物5’端引入顺次排列的位置特异BsaI酶切位点，用于GoldenGate克隆。

或在扩增引物5’端加入互补序列用于GibsonAssembly连接克隆。

为了提高构建好的多靶点载体的稳定性，避免在农杆菌或者植物基因组中sgRNA表达盒之间发生同源重组，从水稻克隆了4个不同snRNA启动子（OsU3,OsU6a，OsU6b，OsU6c），用于单子叶植物；从拟南芥中克隆了4个不同snRNA启动子（AtU3b，AtU3d，AtU6-1，AtU6-29），用于双子叶植物。

Figure3．（A）OverallstructureofeightbasicsgRNAintermediatevectors.（B）ThetwoBsaIcuttingsequencesaregivenintwelvesgRNAvectors（inalinearform）,includingotherfourvectors（pYLsgRNA-OsU3/LacZ,pYLsgRNA-OsU6a/LacZ,pYLsgRNA-AtU3b/LacZ,andpYLsgRNA-AtU3d/LacZ）thathaveanadditionalLacZgene（198bp）asacloningselectionmarker.TheU3andU6promotersfromrice（Os）andArabidopsis（At）andthesgRNAsequenceareseparatedbythevectorbackbone,toavoidamplificationoftheuncutplasmidsbyPCRwithshortextensiontimeduringtheconstructionofsgRNAexpressioncassettes.Cutting（smallarrows）withBsaIproducesdifferentnon-palindromicstickyendstothepromotersandanendtothesgRNAsequence.（C）Arepresentativeregulartargetandanirregulartarget,theirtargetadaptorsfortheOsU6apromoter,andthetranscribed5’sequencesareshown.Aligatedtarget-sgRNAexpressioncassetteisamplifiedbynestedPCRusingprimersU-F/gR-RandPps/Pgs.PpsandPgsareposition-specificprimerswithBsaIsitesfortheGoldenGateligation（TableS1）,orwithoverlappingendsforGibsonAssembly（TableS3）.

3.靶位点选择和接头设计

3.1靶位点选择

建议对1个目的基因设计2个靶点（尤其只有一个靶基因），以降低某靶点打靶不成功的风险。

可在ORF5’区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。

设计靶点的原则：

（1）目的基因（转录方向）的正链和负链靶点的打靶效率大致相同，都可以设计靶点；

（2）Regulartargets&irregulartargets（见以下说明）有同等打靶效率；

（3）靶点的GC%尽量不要低于40%，靶点序列GC%偏高（50-70%）有较高的打靶效率。

靶点内（按5-N20NGG-3方向）不要有连续4个以上的T，以防RNAPolIII将其作为转录终止信号；

（4）虽然非特异打靶（脱靶）对植物基因打靶不是很重要的问题，但应进行靶点特异性分析：

用靶点+NGG（前后各加几十碱基）与基因组做blast（选Somewhatsimilarsequences），避免使用与同源序列差异少于5个碱基的靶点（在切点附近和PAM可有2个碱基差异就具有特异性）。

可以使用在线软件CRISPR-P（targets（AN19NGG或GN19NGG），见以下关于Regulartarget&irregulartarget说明。

（5）打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，选择同源基因中碱基完全相同的区域为靶位点。

（6）把靶点序列连接到sgRNA序列的5’端[（20bptarget）GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT],利用在线软件RNAFoldingForm（http:

//mfold.rna.albany.edu/?

q=mfold/RNA-Folding-Form2.3）做二级结构分析。

靶序列与sgRNA序列产生连续配对7bp（注意：

RNA可以产生U-G配对）以上会抑制其与染色体DNA靶序列结合靶点，因此要避免使用连续配对7bp以上的靶序列。

3.2靶点接头设计

U6/U3基因由III型RNA聚合酶转录，转录起始点