实习二食品蛋白质及氨基酸的测定PPT推荐.ppt

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一些蛋白质的含氮量一些蛋白质的含氮量n一些蛋白质的含氮量一些蛋白质的含氮量一般为一般为15%-17.6%15%-17.6%，有的上下浮动可以，有的上下浮动可以测出总氮测出总氮NN=N6.25=蛋白质含量蛋白质含量2.2.蛋白质定量法蛋白质定量法一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法由由KieldhlKieldhl于于18331833年提出，现发展为常量、微量、自动定年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。

书中只介绍前三种。

氮仪法，半微量法及改良凯氏法。

1.1.原理原理样品与样品与浓硫酸浓硫酸和和催化剂催化剂一同加热一同加热消化消化（digest）（digest），使蛋白质分，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出。

解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出。

而样品中的而样品中的有机氮有机氮（organicnitrogen）（organicnitrogen）转化为氨与硫酸结合转化为氨与硫酸结合成成硫酸铵硫酸铵。

然后加然后加碱碱蒸馏，使蒸馏，使氨氨蒸出，用蒸出，用硼酸硼酸吸收后再以标准盐酸或硫吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。

酸溶液滴定。

整个过程分三步：

消化、蒸馏、吸收与滴定整个过程分三步：

消化、蒸馏、吸收与滴定（11）消化）消化总反应式：

总反应式：

加硫酸钾：

作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点沸点340340，加入硫酸钾之后可以提高至，加入硫酸钾之后可以提高至400400以以上。

也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效上。

也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。

果不如硫酸钾。

加硫酸铜：

作为催化剂。

还可以作消化终点指示作为催化剂。

还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。

还可以加氧化汞、剂（做蒸馏时碱性指示剂）。

还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。

汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。

加氧化剂：

如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。

化速度。

消化装置消化装置“自动回流消化仪自动回流消化仪”（22）蒸馏）蒸馏消消化化完完全全的的样样品品溶溶液液，浓浓氢氢氧氧化化钠钠使使呈呈碱碱性性，加加热热蒸蒸馏馏，即即可可释释放放出出氨气氨气（NH（NH44）22SOSO44+2NaOHNH+2NaOHNH33+Na+Na22SOSO44+2H+2H22OO（3（3）吸收与滴定）吸收与滴定（titration）（titration）吸收：

吸收：

加热蒸馏所放出的氨，加热蒸馏所放出的氨，硼酸硼酸溶液溶液滴定：

滴定：

盐酸标准溶液，盐酸标准溶液，硼硼酸酸呈呈微微弱弱酸酸性性（KaKa11=5.8=5.81010-10-10），用用酸酸滴滴定定不不影影响响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用也也可可采采用用硫硫酸酸或或盐盐酸酸标标准准溶溶液液吸吸收收，然然后后再再用用氢氢氧氧化化钠钠标标准准溶溶液液反反滴滴定定吸吸收收液液中中过过剩剩的的硫硫酸酸或或盐盐酸酸，从从而而计计算算总氮量总氮量22、适用范围（、适用范围（application）application）此此法法可可应应用用于于各各类类食食品品中中蛋白质含量测定。

蛋白质含量测定。

33、试剂、试剂浓硫酸：

脱水、氧化浓硫酸：

脱水、氧化硫酸铜：

催化剂及消化指示剂硫酸铜：

催化剂及消化指示剂硫酸钾：

提高溶液的沸点硫酸钾：

提高溶液的沸点氢氧化钠氢氧化钠混合指示剂混合指示剂:

甲基红甲基红+溴甲酚绿溴甲酚绿硼酸硼酸盐酸盐酸44、操作方法、操作方法（11）消化：

）消化：

固固体体样样品品0.2-2g0.2-2g，半半固固体体样样品品2-5g2-5g，液液体体样样品品10-20ml10-20ml，加加入入催催化化剂剂及及浓浓硫硫酸酸进进行行消消化化至至溶溶液绿色透明。

（同时做空白实验）液绿色透明。

（同时做空白实验）（22）蒸馏：

）蒸馏：

按装置进行连接，奈氏试剂检查，无红棕色按装置进行连接，奈氏试剂检查，无红棕色物质生成物质生成（检查氨是否全部蒸完检查氨是否全部蒸完），蒸馏过程中用硼酸吸，蒸馏过程中用硼酸吸收。

收。

（33）滴定：

）滴定：

用用0.1000mol/L0.1000mol/L盐酸滴定至由兰色变为微红盐酸滴定至由兰色变为微红色。

（甲基红为指示剂）色。

（甲基红为指示剂）5.蛋白质计算蛋白质计算（V1V0）C0.014F100蛋白质蛋白质=mnV1V0滴定时所耗盐酸标准溶液的毫升数；

滴定时所耗盐酸标准溶液的毫升数；

C标准盐酸溶液的当量浓度；

标准盐酸溶液的当量浓度；

0.141毫升当量氮的克数；

毫升当量氮的克数；

F氮的蛋白质换算系数；

氮的蛋白质换算系数；

m样品克数。

样品克数。

n稀释倍数稀释倍数6.6.注意事项注意事项当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入3030过氧化氢过氧化氢223m13m1后再继续加热消化。

后再继续加热消化。

消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。

氮损失。

样品含脂肪或糖较多时，消化时间要长些。

同时注意消化过样品含脂肪或糖较多时，消化时间要长些。

同时注意消化过程中产生泡沫溢出瓶外。

程中产生泡沫溢出瓶外。

在蒸馏过程中注意接头处有无松漏现象。

蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸11分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。

分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。

二、微量凯氏定氮法二、微量凯氏定氮法11、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前22、与常量法不同点：

、与常量法不同点：

加入硼酸量有加入硼酸量有50ml50ml、10ml,10ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1mol/L-0.01mol/L,0.1mol/L-0.01mol/L,可用微量滴定管。

可用微量滴定管。

33、蒸馏装置、蒸馏装置三、自动凯氏定氮法三、自动凯氏定氮法n11、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前n22、特点：

、特点：

n（11）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。

线加热的消化炉。

n（22）快速：

一次可同时消化）快速：

一次可同时消化88个样品，个样品，3030分钟可消分钟可消化完毕。

化完毕。

n（33）自动：

自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动）自动：

自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。

可计算总氮百分含量并记录，数字显示装置。

可计算总氮百分含量并记录，1212分分钟完成钟完成11个样。

个样。

四、双缩脲法四、双缩脲法传传统统的的凯凯氏氏定定氮氮法法应应用用范范围围广广，灵灵敏敏度度高高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。

准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。

新开发的：

双缩脲法、新开发的：

双缩脲法、紫外分光光度法、紫外分光光度法、染料结合法、染料结合法、水杨酸比色法等。

水杨酸比色法等。

n都是快速测定蛋白质的方法都是快速测定蛋白质的方法11、原理、原理当脲（尿素当脲（尿素NHNH22COCONHNH22）加热至加热至150150160160时，时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应式如下：

（也叫双缩脲），反应式如下：

四、双缩脲法四、双缩脲法n双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应。

的配合物，此反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子含有肽键蛋白质分子含有肽键,与与双双缩缩脲脲结结构构相相似似，故故也也能能呈呈现现此此反反应应而而生生成紫红色配合物成紫红色配合物在在一一定定条条件件下下其其颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质含含量量成成正正比比，据据此此可可用用吸吸收收光光度度法法来来测测定定蛋蛋白白质质含含量，该配合物的最大吸收波长为量，该配合物的最大吸收波长为560nm560nm。

2.2.方法特点及应用范围方法特点及应用范围本本法法灵灵敏敏度度较较低低，但但操操作作简简单单快快速速，故故在在生生物物化化学学领领域域中中测测定定蛋蛋白白质质含含量量时时常常用用此此法法。

本本法法亦亦适适用用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定3.3.主要仪器主要仪器：

分光光度计，离心机（分光光度计，离心机（4000r/min4000r/min）4.4.试剂：

试剂：

（1）

（1）碱性硫酸铜溶液碱性硫酸铜溶液

（2）

（2）四氯化碳四氯化碳5操作方法操作方法标准曲线的绘制标准曲线的绘制采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。

采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。

显色（加入试剂静置显色（加入试剂静置11小时）小时）比色（取上清离心）比色（取上清离心）样品的测定样品的测定显色显色比色比色查标准曲线查标准曲线66、结果计算、结果计算蛋白质（蛋白质（mg/100gmg/100g）=式中：

式中：

cc由标准曲线上查得的蛋白质由标准曲线上查得的蛋白质mgmg数；

数；

mm样品质量，样品质量，gg77、说明及注意事项、说明及注意事项蛋白质的种类不同，对发色程度的影响蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不不大大，有有大大量量脂脂肪肪存存在在时时，会会出出现现混混浊浊可可以先脱脂以先脱脂标准曲线作完整后，无需每次再作标准标准曲线作完整后，无需每次再作标准曲线曲线样品含有脯氨酸且有大量糖类存在时，样品含有脯氨酸且有大量糖类存在时，显色不好还会出现结果偏低。

显色不好还会出现结果偏低。

五、紫外吸收法五、紫外吸收法1原理：

利用蛋白质的特有基团，对紫外光有原理：

利用蛋白质的特有基团，对紫外光有吸收作用在吸收作用在280nm280nm下，吸光度与蛋白质浓度成下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。

直线关系，求含量。

22适用范围：

常用于生物化学工作，因为干扰适用范围：

常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。

因素多，故在食品分析领域应用不广泛。

33主要仪器：

主要仪器：

紫外分光光度计紫外分光光度计离心机（离心机（30005000r/min30005000r/min）44操作：

用凯氏法测定作标样做标准曲线操作