thEPOFc融合蛋白质量标准的研究文档格式.docx
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所建立的质控方法已用于rhEPO-Fc制品的检定,可以有效地控制rhEPO-Fc制品的质量。
关键词:
rhEPO-Fc免疫球蛋白Fc段融合蛋白质量标准
促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是人体内调控红系祖细胞的重要造血因子,能促进骨髓中红系造血祖细胞的增殖、分化及血红蛋白合成。
天然存在的EPO药源极为匮乏,不能满足临床需求。
重组人红细胞生成素是利用基因工程技术,将人的EPO基因转入CHO细胞内分泌表达获得的活性糖蛋白,用于慢性肾衰竭和癌症化疗产生的贫血。
然而,rhEPO制剂在人体内血清循环半衰期仅为4h～8h,需要经常给药,增加了患者治疗成本,严重降低了患者的生活质量。
因此如何显著延长rhEPO的半衰期,已成为当前生物制药领域中一个极具实用价值的研究热点。
本研究采用的rhEPO-Fc融合蛋白制品是将编码人IgGFc段的基因与编码人EPO的基因片段连接,并将其克隆至高表达质粒载体中,用该质粒转染CHO细胞进行分泌表达所得。
IgG型的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质,它们的半衰期可长达21d,因此rhEPO-Fc融合蛋白的肾小球滤过率减小,半衰期明显延长,能更好地应用于临床。
将人IgG的Fc区域与其它蛋白质结合形成融合蛋白以延长半衰期已有报道[1],这种制备融合蛋白的方法已用于一些重要的细胞因子（如IL-2和IFNa-2a）和可溶性受体（如TNF-Rc和IL-5-Rc）[2,3]。
本文对rhEPO-Fc融合蛋白的生物学活性、分子特性及结构进行了研究,通过优化实验条件,确定了可控的质量标准,同时也为人IgG的Fc段修饰的蛋白类药物的研究与开发提供了有效的检测手段和经验。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞
32D1.9细胞为本公司常规传代保存。
1.1.2试剂
白蛋白国家标准品购自中国药品生物制品检定所;
DIGDNAlabelinganddetectionkit购自Roche公司;
EPOELISAkit购自R&
amp;
D公司,rhEPO-Fc为本公司制备。
1.1.3仪器
日本岛津LC2010A高效液相色谱仪,Bio-RadMini-Ⅱ垂直电泳系统,Bio-RadPowerPac3000等电聚焦电泳系统,Model550型自动酶标仪,ThermoBiomate6紫外可见蛋白核酸分析仪。
1.2方法
1.2.1体外生物学活性测定
细胞MTT比色法测定效价[4],采用EPO依赖型细胞32D1.9细胞株,将32D1.9细胞稀释成3×
105悬液后铺96孔板,将参考品及样品均稀释为0.0006,0.002,0.006,0.02,0.06,0.2,0.6,2,6,20,60nm,与细胞等体积分别加入孔中,设阴性对照,37℃培养,于第四天每孔加入MTT检测试剂,酶标仪540/690nm读取吸光度值。
酶联免疫法采用R&
D公司ELISAkit,450/600nm处读取吸光度值。
1.2.2蛋白质含量
按照2010版《中华人民共和国药典》蛋白质测定法第二法（Lowry法）进行[5]。
1.2.3相对分子质量测定
采用还原型SDS-PAGE法,分离胶12%,浓缩胶5%,上样量5μg,考马斯亮蓝R-250染色。
1.2.4纯度测定
采用SDS-PAGE法,上样量10μg,及高效液相色谱法（HPLC）（色谱柱:
Shim-PackDiol300,流动相:
20mMPBSpH7.4溶液;
时间:
15min;
流速:
1ml/min;
检测波长:
280nm;
柱温:
25℃）测定。
1.2.5紫外光吸收光谱分析
按照2010版《中华人民共和国药典》中紫外可见分光光度法进行。
1.2.6外源性DNA残留量测定
采用固相斑点杂交法,以DIG标记核酸检测试剂盒测定,用于探针标记和阳性对照的DNA由生产供试品的CHO细胞提取纯化获得,应无RNA及寡核苷酸存在。
阳性对照DNA点样100pg到0.1pg5个梯度,检测样品点样1/10人份剂量,尼龙膜于120℃干烤30min变性,40℃杂交过夜。
1.2.7等电点测定
采用等电聚焦垂直电泳法,阴极缓冲液2mMNaOH溶液,阳极缓冲液1mMH3PO4溶液,样品采用透析或者脱盐柱脱盐处理,上样量2mg以上,考马斯亮蓝染色。
1.2.8唾液酸含量测定[6]
按照2010版《中华人民共和国药典》采用间苯二酚显色法,在酸性条件下,唾液酸成游离状态,与间苯二酚反应生成有色化合物后用乙酸丁酯/丁醇（4∶1）萃取,580nm处测定吸光度,以唾液酸对照品的浓度对其吸光度作直线回归,计算唾液酸含量。
2结果
2.1体外生物学活性测定
本研究对MTT比色法适用于rhEPO-Fc融合蛋白的生物学活性检测进行了方法学验证,结果显示rhEPO-Fc融合蛋白具有天然EPO的生物学活性,可呈剂量依赖性地刺激32D1.9细胞的增值,该方法具有专属性,比活性可达105IU/mg以上,样品比活性为参考品的120%;
ELISA法测定剂量反应曲线的相关系数为0.9992,结果与MTT法一致。
2.2蛋白质含量
以白蛋白国家标准品为标准,用直线回归法计算样品蛋白浓度为1.58mg/ml。
2.3相对分子质量
rhEPO-Fc经SDS-PAGE还原法测得的相对分子质量约在59千道尔顿附近,标准蛋白分子量为200KD,130KD,97.4KD,66.2KD,43KD,见图1。
2.4纯度
SDS-PAGE后扫描测得非还原样品纯度为98.5%,见图1;
HPLC法本文检测了3批样品,并且每批样品重复检测3次,保留时间均约为6.99min左右,纯度为99.659%,见图2。
2.5紫外光谱检测
紫外最大吸收峰约为278nm,说明rhEPO经修饰后紫外最大吸收峰没有改变。
2.6外源性DNA残留量测定
经1%琼脂糖凝胶电泳及分光光度法鉴定阳性对照DNA的纯度:
无RNA及寡核苷酸存在,A260/A280比值为1.84。
按上述实验方法及条件检测,显色结果见图3。
标记探针检测样品rhEPO-Fc中的DNA残留量小于10pg/mg。
2.7等电点
经等电聚焦电泳法扫描,测得rhEPO-Fc的等电点落在4.5～6.5范围内,这与rhEPO一致,说明结合Fc片段后等电点未改变。
2.8唾液酸含量测定
1nmolrhEPO-Fc的量（不包括糖成分量）,相当于80.1mg,rhEPO-Fc样品的质谱分子量为109KD,计算得出唾液酸含量为11.92mol/mol蛋白质。
3结语
rhEPO与人IgG的Fc区域结合形成融合蛋白后,分子量由原来的30KD增至59KD,血清循环半衰期显著延长,因而在临床上能更好地发挥作用。
目前还没有检测和控制该制品的方法和质量标准,我们结合rhEPO的理化和生物学特征,研究了测定rhEPO-Fc融合蛋白的方法。
体外活性检测中,MTT比色法重复性好且成本较低,但缺点是周期长。
ELISA法操作方便,特异性高且周期短,适合于rhEPO-Fc比活性的快速检测,但成本较高。
两种方法检测结果一致,因此可以相互补充,针对样品不同的测定需求选择适合的测定方法,使rhEPO-Fc体外活性的检测更完善、准确、经济可行。
rhEPO-Fc有8个糖基化位点,其中6个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点。
有文献报道[7],如果糖基化程度不高,虽有体外活性,但很难有体内活性。
若缺乏糖链,rhEPO-Fc融合蛋白在体内迅速被水解而失活。
糖基成分主要是唾液酸,而等电聚焦电泳可以检测N-糖链上唾液酸位点的完整性[8],因此唾液酸含量检测及等电聚焦电泳是控制rhEPO-Fc融合蛋白的重要指标。
由于生产过程中使用了真核细胞CHO细胞,而残留的宿主细胞DNA是重组药物中特有的潜在致癌性杂质[9],因此对rp参考文献
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