thEPOFc融合蛋白质量标准的研究文档格式.docx

1、所建立的质控方法已用于rhEPO-Fc制品的检定,可以有效地控制rhEPO-Fc制品的质量。关键词:rhEPO-Fc 免疫球蛋白Fc段 融合蛋白 质量标准促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是人体内调控红系祖细胞的重要造血因子,能促进骨髓中红系造血祖细胞的增殖、分化及血红蛋白合成。天然存在的EPO药源极为匮乏,不能满足临床需求。重组人红细胞生成素是利用基因工程技术,将人的EPO基因转入CHO细胞内分泌表达获得的活性糖蛋白,用于慢性肾衰竭和癌症化疗产生的贫血。然而,rhEPO制剂在人体内血清循环半衰期仅为4h8h,需要经常给药,增加了患者治疗成本,严重降低了患者的生活质量。因此

2、如何显著延长rhEPO的半衰期,已成为当前生物制药领域中一个极具实用价值的研究热点。本研究采用的rhEPO-Fc融合蛋白制品是将编码人IgG Fc段的基因与编码人EPO的基因片段连接,并将其克隆至高表达质粒载体中,用该质粒转染CHO细胞进行分泌表达所得。IgG型的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质,它们的半衰期可长达21d,因此rhEPO-Fc融合蛋白的肾小球滤过率减小,半衰期明显延长,能更好地应用于临床。将人IgG的Fc区域与其它蛋白质结合形成融合蛋白以延长半衰期已有报道1,这种制备融合蛋白的方法已用于一些重要的细胞因子（如IL-2和IFNa-2a）和可溶性受体（如TNF-Rc和IL-5-

3、Rc）2,3。本文对rhEPO-Fc融合蛋白的生物学活性、分子特性及结构进行了研究,通过优化实验条件,确定了可控的质量标准,同时也为人IgG的Fc段修饰的蛋白类药物的研究与开发提供了有效的检测手段和经验。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞32D1.9细胞为本公司常规传代保存。1.1.2 试剂白蛋白国家标准品购自中国药品生物制品检定所;DIG DNA labeling and detection kit购自Roche公司;EPO ELISA kit 购自R&D公司,rhEPO-Fc为本公司制备。1.1.3 仪器日本岛津LC2010A高效液相色谱仪,Bio-Rad Mini-垂直电

4、泳系统,Bio-Rad PowerPac3000等电聚焦电泳系统,Model550型自动酶标仪,Thermo Biomate 6紫外可见蛋白核酸分析仪。1.2 方法1.2.1体外生物学活性测定细胞MTT比色法测定效价4,采用EPO依赖型细胞32D1.9细胞株,将32D1.9细胞稀释成3105悬液后铺96孔板,将参考品及样品均稀释为0.0006,0.002,0.006,0.02,0.06,0.2,0.6,2,6,20,60nm,与细胞等体积分别加入孔中,设阴性对照,37培养,于第四天每孔加入MTT检测试剂,酶标仪540/690nm读取吸光度值。酶联免疫法采用R&D公司ELISA kit,450/

5、600nm处读取吸光度值。1.2.2 蛋白质含量按照2010版中华人民共和国药典蛋白质测定法第二法（Lowry法）进行5。1.2.3 相对分子质量测定采用还原型SDS-PAGE法,分离胶12%,浓缩胶5%,上样量5g,考马斯亮蓝R-250染色。1.2.4 纯度测定采用SDS-PAGE法,上样量10g,及高效液相色谱法（HPLC）（色谱柱:Shim-Pack Diol 300,流动相:20mM PBS pH7.4溶液;时间:15min;流速:1ml/min;检测波长:280nm;柱温:25）测定。1.2.5 紫外光吸收光谱分析按照2010版中华人民共和国药典中紫外可见分光光度法进行。1.2.6

6、外源性DNA残留量测定采用固相斑点杂交法,以DIG标记核酸检测试剂盒测定,用于探针标记和阳性对照的DNA由生产供试品的CHO细胞提取纯化获得,应无RNA及寡核苷酸存在。阳性对照DNA点样100pg到0.1pg 5个梯度,检测样品点样1/10人份剂量,尼龙膜于120干烤30min变性,40杂交过夜。1.2.7 等电点测定采用等电聚焦垂直电泳法,阴极缓冲液2mM NaOH溶液,阳极缓冲液1mM H3PO4溶液,样品采用透析或者脱盐柱脱盐处理,上样量2mg以上,考马斯亮蓝染色。1.2.8 唾液酸含量测定6按照2010版中华人民共和国药典采用间苯二酚显色法,在酸性条件下,唾液酸成游离状态,与间苯二酚反

7、应生成有色化合物后用乙酸丁酯/丁醇（41）萃取,580nm处测定吸光度,以唾液酸对照品的浓度对其吸光度作直线回归,计算唾液酸含量。2 结果2.1 体外生物学活性测定本研究对MTT比色法适用于rhEPO-Fc融合蛋白的生物学活性检测进行了方法学验证,结果显示rhEPO-Fc融合蛋白具有天然EPO的生物学活性,可呈剂量依赖性地刺激32D1.9细胞的增值,该方法具有专属性,比活性可达105IU/mg以上,样品比活性为参考品的120%;ELISA法测定剂量反应曲线的相关系数为0.9992,结果与MTT法一致。2.2 蛋白质含量以白蛋白国家标准品为标准,用直线回归法计算样品蛋白浓度为1.58mg/ml。

8、2.3 相对分子质量rhEPO-Fc经SDS-PAGE还原法测得的相对分子质量约在59千道尔顿附近,标准蛋白分子量为200KD,130KD,97.4KD,66.2KD,43KD,见图1。2.4 纯度SDS-PAGE后扫描测得非还原样品纯度为98.5%,见图1;HPLC法本文检测了3批样品,并且每批样品重复检测3次,保留时间均约为6.99min左右,纯度为99.659%,见图2。2.5 紫外光谱检测紫外最大吸收峰约为278nm,说明rhEPO经修饰后紫外最大吸收峰没有改变。2.6 外源性DNA残留量测定经1%琼脂糖凝胶电泳及分光光度法鉴定阳性对照DNA的纯度:无RNA及寡核苷酸存在,A260/A

9、280比值为1.84。按上述实验方法及条件检测,显色结果见图3。标记探针检测样品rhEPO-Fc中的DNA残留量小于10pg/mg。2.7 等电点经等电聚焦电泳法扫描,测得rhEPO-Fc的等电点落在4.56.5范围内,这与rhEPO一致,说明结合Fc片段后等电点未改变。2.8 唾液酸含量测定1nmol rhEPO-Fc的量（不包括糖成分量）,相当于80.1mg,rhEPO-Fc样品的质谱分子量为109KD,计算得出唾液酸含量为11.92mol/mol蛋白质。3 结语rhEPO与人IgG的Fc区域结合形成融合蛋白后,分子量由原来的30KD增至59KD,血清循环半衰期显著延长,因而在临床上能更好

10、地发挥作用。目前还没有检测和控制该制品的方法和质量标准,我们结合rhEPO的理化和生物学特征,研究了测定rhEPO-Fc融合蛋白的方法。体外活性检测中,MTT比色法重复性好且成本较低,但缺点是周期长。ELISA法操作方便,特异性高且周期短,适合于rhEPO-Fc比活性的快速检测,但成本较高。两种方法检测结果一致,因此可以相互补充,针对样品不同的测定需求选择适合的测定方法,使rhEPO-Fc体外活性的检测更完善、准确、经济可行。rhEPO-Fc有8个糖基化位点,其中6个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点。有文献报道7,如果糖基化程度不高,虽有体外活性,但很难有体内活性。若缺乏糖链,rhEPO-F

11、c融合蛋白在体内迅速被水解而失活。糖基成分主要是唾液酸,而等电聚焦电泳可以检测N-糖链上唾液酸位点的完整性8,因此唾液酸含量检测及等电聚焦电泳是控制rhEPO-Fc融合蛋白的重要指标。由于生产过程中使用了真核细胞CHO细胞,而残留的宿主细胞DNA是重组药物中特有的潜在致癌性杂质9,因此对rp参考文献1 Chamow SM,Ashkenazi A.Immunoa-dhesins:principles and applications.Trends Biotechnol,1996,14（2）:5260.2 Landolfi NF.Chimeric ligand/immunoglobulin mol

12、ecules and their uses.US Patent,1994,9（5）:349.3 Smith CA,Goodwin RG,Beckmann MP.Tumor necrosis factor-alpha and beta receptors.US Patent,2001,5（6）:224.4 韩蕾,韩文跃.MTT比色法与ELISA测定rhEPO体外生物学活性比较J.细胞与分子免疫学杂志,2000,16（5）:450453.5 国家药典委员会.中华人民共和国药典S.北京,中国医药科技出版社,2010.6 邓健,袁亚莉,许金生,等.协同催化-溶剂萃取光度法测定血清中的唾液酸J. 化学分

13、析计量,2001,10（1）:910.7 Delorme E,Lorenzini T,Giffin J.Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin.Biochemistry,1992,31（41）:98719876.8 Steve Elliott, Joan Egrie, JeffBrowne, et al.Control of rHuEPO biological activity:The role of carbohydrate1Experimental Hematology,2004,32（12）:11461155.9 佘清.第57届WHO生物制品标准化专家委员会会议简况J.中国药品标准,2007,8（1）:7779.10 Ji X,Lee K, DiPaolo B. Highsensitivity hybridization assay for quantitation of residual E.coli DNA J. Biotechniques,2002,32:11621167.