大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化文档格式.docx
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作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：
遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。
具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。
以下是实验室常用的几种表达宿主：
BL2：
lon和ompT蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。
是经典的使用最广泛的表达受体。
适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。
BL21（DE3）：
DE3噬菌体溶源于BL21形成的带有染色体T7RNA聚合酶基因大肠杆菌。
IPTG诱导的lacΜV5启动子控制T7RNA聚合酶基因表达T7RNA聚合酶，进而控制T7表达系统表达目的蛋白。
BL21（DE3）衍生系列：
在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。
比如：
Origami（DE3），OrigamiB（DE3）和Rosetta-gami（DE3）菌株带有trxB和gor双突变。
拥有trxB和gor突变的菌株比单具，trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。
Rosetta™系列：
是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。
经提高稀有tRNA水平，可以提高一些真核基因表达效率（更多信息可参考相应公司的资料）。
BL21-CodonPlus系列：
包括BL21-CodonPlus®
（DE3）-RIPL，BL21-CodonPlμs®
-RIL，BL21-CodonPlμs®
（DE3）-RIL,BL21-CodonPlμs®
-RP，BL21-CodonPlus®
（DE3）-RP等。
这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R），亮氨酸（L），异亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA基因，更多用于表达一些真核生物的基因。
其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene公司资料）。
M15/SG13009：
自身表达T5RNApolymerase，主要用于pQE系列载体的表达。
另一个需要考虑的是大肠杆菌的密码子及其偏爱性。
表1大肠杆菌密码子使用频率统计
T
AA
FRQ
C
A
G
TTT
F
19.7
TCT
S
5.7
TAT
Y
16.8
TGT
5.9
TTC
15
TCC
5.5
TAC
14.6
TGC
8
TTA
L
15.2
TCA
7.8
TAA
stop
1.8
TGA
1
TTG
11.9
TCG
TAG
TGG
W
10.7
CTT
12
CCT
P
8.4
CAT
H
15.8
CGT
R
21.1
CTC
11
CCC
6.4
CAC
13.1
CGC
26
CTA
5.3
CCA
6.6
CAA
Q
12.1
CGA
4.3
CTG
46.9
CCG
26.7
CAG
27.7
CGG
4.1
ATT
I
30.5
ACT
AAT
N
21.9
AGT
7.2
ATC
30.6
ACC
22.8
AAC
24.4
AGC
16.6
ATA
30.7
ACA
AAA
K
33.2
AGA
1.4
ATG
M
30.8
ACG
11.5
AAG
AGG
1.6
GTT
V
GCT
GAT
D
37.9
GGT
21.3
GTC
16.9
GCC
31.6
GAC
20.5
GGC
33.4
GTA
16.1
GCA
GAA
E
43.7
GGA
9.2
GTG
16.11
GCG
38.5
GAG
18.4
GGG
8.6
8.2表达条件的建立
为了方便后续的纯化操作,保持目标蛋白的活性,提高蛋白的得率，我们在进行蛋白的大量制备之前应该首先确定目标蛋白的最佳表达条件。
首先，保证表达蛋白稳定，尽量避免蛋白酶的降解，我们可以通过使用一些蛋白酶缺陷性的表达宿主，其次在表达的过程中可以在培养体系中添加一些蛋白酶抑制剂等来解决。
与实现外源蛋白的稳定表达相比，更多时候保证目标蛋白的可溶性表达，是建立表达条件的主要工作。
很多外源基因在大肠杆菌表达时很容易形成不可容的包涵体，其原因可能有：
表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体；
蛋白合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；
过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
目前对包涵体的形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚,但已经报道了很多用于优化表达以增加目标蛋白可溶性的方法。
8.2.1确定表达状况
转化构建好的质粒至表达宿主感受细胞，挑取单克隆子至5ml含有相应抗性的LB培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600=0.5左右，加入IPTG至终浓度0.2mM，转移至28℃，200rpm继续诱导培养，可以在2h，4h，6h分别取样以分析表达状况。
将取出的1ml菌液12000rpm离心1min，收集菌体，加入1mlPBS缓冲液重悬沉淀，同样离心1min。
再加入300～500mlPBS重悬细胞。
超声破碎细胞（具体见操作细胞破碎）
将破碎液体4℃，12000rpm离心10min，分离上清和沉淀。
SDS-PAGE分析上清和沉淀的蛋白分布（具体操作参考SDS-PAGE）。
若在上清中有明显的目的蛋白的条带，即可以放大培养进而纯化目标蛋白。
若目标蛋白的表达主要分布于沉淀，则可以尝试一下几种方法来改善表达。
改变表达载体下手，像GST，NΜS，MBP,TrxA等融合标签能够提高很多蛋白在大肠杆菌中表达的可溶性，此外一些分泌标签如ompA,Pet-22b上的pelB也能够将目标蛋白运输至细胞的周质空间，从而提高目标蛋白的可溶性。
降低表达速度，可采取低温诱导，如15℃诱导过夜，或者采用弱启动子表达载体。
尝试一些特殊设计的表达宿主Origami：
thioredoxinredμctase/glμtathioneredμctase双突变适合带thioredoxinredμctase的融合表达载体，帮助形成更多的二硫键。
对于一些蛋白可能无法实现可溶性表达，这时候溶解包涵体后再纯化是唯一的解决办法。
8.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
大肠杆菌表达纯化外源蛋白，SDS-PAGE是必不可少的操作。
可以用来检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布等），用来分析纯化的目的蛋白的纯度。
本小节列出SDS-PAGE操作中一些试剂的配置及其基本的操作过程。
8.2.2.1主要试剂的配置
（1）30%丙烯酰胺贮存液：
29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。
置棕色瓶中，4℃保存。
丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。
建议实验室划出专门的台面，设置单独的配置器皿进行SDS-PAGE的相关实验。
（2）1.5mol/LTris（pH8.8）溶液。
（3）10%SDS溶液：
SDS10.0g加入ddH2OToTo100。
（4）10%过硫酸铵：
新鲜配制。
（5）TEMED溶液：
4℃保存。
（6）1.0mol/LTris（pH6.8）溶液。
（7）2×
样品溶解液：
2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液。
（8）5×
Tris-甘氨酸电极缓冲液：
15.1gTris，94g甘氨酸和5gSDS定容到1000ml（建议每次电泳用新稀释的缓冲液）。
（9）考马斯亮蓝R染色液：
每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:
9:
2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R，搅拌溶解。
（10）脱色液：
10%冰醋酸（可加如乙醇，建议不要使用甲醇）。
8.2.2.2主要操作步骤
1、凝胶制备
（1）安装洗涤干净的玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中。
（2）配制10%的分离胶（具体参考表2）：
迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。
小心在胶上覆盖一薄层异丙醇或水。
（3）在分离胶聚合的过程（可置于37℃，
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