FAVD116复方醋酸曲安奈德搽剂微生物限度检查方法验证方案解读Word下载.docx

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本方案实施前应对参加验证人员进行培训，并做好培训记录确保进行验证的人员均能熟悉、掌握验证过程。

5验证方案

5.1制剂信息

复方醋酸曲安奈德搽剂为醋酸曲安奈德和盐酸普鲁卡因溶于75%乙醇配制而成，其溶剂75%乙醇为水溶性，常作为消毒剂使用，有很强的抑菌活性。

其质量标准中规定应进行微生物限度检查，每1ml样品中细菌数不得超过100cfu，霉菌和酵母菌数不得超过100cfu，并不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

根据以上特点，本方案中按《中国药典》2015版草案《非无菌产品微生物限度检查：

微生物计数法》（1105）和《非无菌产品微生物限度检查：

控制菌检查法》（1106）中相关要求，决定采用稀释剂稀释法消除乙醇对结果的影响，制备供试品溶液；

采用平皿法中的倾注法对供试品中的需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数进行计数，根据草案对其质量标准中规定的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行检查，并对所选用的计数和检查方法进行验证。

5.2微生物限度检查法概述

5.2.1微生物限度检查法系检查非灭菌制剂及其原料药、辅料受微生物污染程度的方法。

检查项目包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数及控制菌检查。

微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。

5.2.2微生物计数试验和控制菌检查试验应在受控洁净环境下（D级）的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

5.2.3本方案中的检验量即一次试验所用的供试品量（ml）。

除另有规定外，一般供试品的检验量为10ml。

检验时应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。

一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混合，取规定量供试品进行检验。

5.2.4本方案中所使用的试验菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

制备菌液时应估算菌液中的含菌量，以便于控制加入试验菌的菌量，估算时可采用显微镜直接计数法确定。

5.2.5本方案中需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数），霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。

5.2.6本方案中微生物计数结果中需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

取最高的平均菌落数，计算1ml供试品中所含的微生物数。

如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

控制菌检查中应取相当于1mL供试品的供试液进行试验。

5.3验证所需培养基、仪器设备

5.3.1试验用培养基

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）；

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）；

沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）；

沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）；

甘露醇氯化钠琼脂培养基；

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基；

本方案中所使用的培养基均应为购自中国食品药品检定研究院或由其他单位购买但经过适用性检查合格的脱水培养基，配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

5.3.2仪器设备

100级净化工作台；

BSC-1100-LIIA型生物安全柜；

BP-II型药物天平；

HHW21型电热恒温水浴箱；

HY35型隔水式电热恒温培养箱；

LRH-250A型生化培养箱；

三洋MLS-3780型高压灭菌锅。

5.4微生物计数方法验证

5.4.1菌种及菌液制备

5.4.1.1金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕

取金黄色葡萄球菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.2铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕

取铜绿假单胞菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.3枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕

取枯草芽孢杆菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.4白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕

取白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖液体培养基上，于20～25℃、培养2～3天，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.5黑曲霉〔CMCC（F）98003〕

取黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃、培养5～7天，或直到获得丰富的孢子时，取其新鲜培养物加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，反复吹吸将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的黑曲霉孢子悬液。

5.4.2菌液的保存

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；

若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

5.4.3供试液制备

取供试品10ml，加入温度不超过45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，稀释制成1﹕10供试液。

按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。

所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。

供试液从制备至加入检验用培养基不得超过1小时。

（1）试验组取上述制备好的供试液，加入1ml试验菌液，混匀，每1ml供试液中含菌量约为50cfu。

（2）供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液（温度不超过45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）代替菌液同试验组操作。

（3）菌液对照组取稀释液（温度不超过45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

5.4.4阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

5.4.5供试品中微生物的回收

按照“菌种及菌液制备”项中所列的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。

取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”制备的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌）或沙氏葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌、黑曲霉），混匀，凝固，倒置培养（胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天；

沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天）。

观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。

每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数，计算各试验组的平均菌落数。

5.4.6结果判断

试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。

若各试验菌的回收试验均符合要求，则方法验证通过，可照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数；

若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么可采用增加稀释液、培养基体积或加入适宜的中和剂、灭活剂来消除供试品的抑菌活性，并重新进行计数方法适用性验证，根据结果选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。

5.5控制菌检查方法验证

5.5.1金黄色葡萄球菌检查方法

5.5.1.1供试液制备和增菌培养

取10ml供试液，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

5.5.1.2选择和分离培养

取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。

5.5.1.3结果判断

若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；

若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

5.5.2铜绿假单胞菌检查方法

5.5.2.1供试液制备和增菌培养

5.5.2.2选择和分离培养

取上述预培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。

取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其它适宜方法进一步鉴定。

5.5.2.3氧化酶试验

将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

5.5.2.4结果判断

若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。

如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。

5.5.3检查方法验证

5.5.3.1菌液制备

取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕或铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为50cfu的菌悬液。

5.5.3.2适用性试验

按“金黄色葡萄球菌检查方法”或“铜绿假单胞菌检查方法”项，取规定量供试液及1ml相应的试验菌液接入规定的培养基中；

依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。

5.5.3.3阴性对照

5.5.3.4结果判断

上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；

若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不可能存在于该供试品