分子生物学综合实验报告.docx

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分子生物学综合实验报告

综合实验Ⅰ.Southern杂交

（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、

地高辛标记的Southern杂交）

一.实验目的

1.学习Southern杂交的原理及操作方法。

2.学习碱裂解法提取质粒的原理。

3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。

4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。

二.实验原理

利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：

利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：

DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、TaqDNA聚合酶、反应缓冲体系。

PCR循环由三个步骤组成：

变性、退火、延伸。

每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。

DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。

最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。

对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。

一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。

通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。

地高辛随机引物法标记的原理：

在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。

以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。

一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。

免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。

三．实验准备

1.实验材料：

含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基，LB平板培养基

2.实验试剂：

TaqDNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmolMgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶（EB），点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：

0.25%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体，2×ligation缓冲液，T4DNA连接酶，0.1mol/LCaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL），TBE电泳缓冲液（5×），DIGRandomLabelingMix（高效），Anti-DIG-APConjugate，BCIP/NBTStockSolution，BlockingReagent。

20×SSC：

0.3M柠檬酸钠，3MNaCl，2×SSC：

0.03M柠檬酸钠，0.3MNaCl，0.2MEDTA，变性液：

0.5NNaOH，1.5MNaCl，中和度：

0.5MTris-HCl、pH7.4、3MNaCl，Standardbuffer：

5×SSC、0.1%（w/v）N-Lauroylsarcosine,0.02%（w/v）SDS,1%BlockingReagent，Standardbuffer+50%formamide，Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：

0.1MTris-HCl，0.15MNaCl.pH=7.5，封闭液：

1%BlockingReagent/0.1MTris-HCl，0.15MNaCl，显色缓冲液：

0.1mMTris-HCl，0.1MNaCl，pH=9.5，TE缓冲液：

10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0，2%，LB固体培养基（添加amp的终浓度为100μg/ml，添加arabinose为培养基的0.2%），溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，TE缓冲液，无水乙醇和70%乙醇。

3.实验仪器：

微量移液器，1.5ml离心管，DNA吸附柱，DNA收集管，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统，恒温水浴箱，PCR仪，培养皿，超净工作台，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

四．试验方法

1.质粒的提取：

①培养细菌

将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24小时，然后从平板上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37℃培养12小时。

②提取步骤

●取1.5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，6000rpm离心1min，尽量吸除上清，重复两次

●向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

●向离心管中加入250μL溶液P2，温和翻转多次使菌体充分裂解。

●向离心管中加入350μL溶液P3，温和翻转多次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。

12,000rpm离心10min。

●将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpm离心1Min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

●向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

●重复操作步骤6。

●将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min。

●将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心1min将质粒溶液收集到离心管中。

③琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA

2.聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA：

●按下表加入试剂，并小心混匀。

模板为实验一中提取的质粒DNA

试剂

体积（30µl）

ddH2O

12µl

PrimerP1（µM）

1µl

PrimerP2（µM）

1µl

模板

1µl

2xTaqMix

15µl

●设置PCR程序

●运行PCR程序

●反应结束后，取20μlPCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析

3.地高辛标记的Southern杂交：

●将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中，贴壁放置（吸附有核酸的一面不要贴壁），赶走杂交膜和管壁间的气泡。

●加入20mlStandardbuffer，65℃预杂交4-20小时。

●将制备的DNA探针沸水浴加热10min，迅速置冰浴5min。

全部加入杂交管。

●使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。

●杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20以备下次使用。

这样至少可以保存一年。

再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃10分钟以变性探针。

●取出杂交膜，用WashSolutionI洗5分钟×3次。

●保温冲洗：

用WashSolutionII于68℃冲洗15分钟×2次。

4.BCIP/NBT显色检测法：

●经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。

●用干净的平皿，封闭液室温封闭至少60分钟。

●用封闭液1：

2500—5000稀释Anti-DIG-AP，例如2μlAnti-DIG-AP加至5-10ml封闭液中（根据染色情况而调整）。

稀释液4℃可稳定12小时左右。

●加Anti-DIG-AP，37℃反应60分钟。

●用冲洗液洗15分钟×3次，每次100ml。

●按1：

50配制底物显色液：

例如100μl“BCIP/NTP储备液”加至5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。

●显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。

●加100ml底物显色液（100cm2）。

将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。

显色过程中可以观察。

一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12小时。

应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位。

●当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。

结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液，在此情况下，颜色长期不退。

还有一种选择时让膜干燥，颜色消褪。

但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。

五.实验结果及分析

图1中，共有16个条带，说明大家都提取成功了，只是右边几个亮度比其他的低，说明提取的DNA含量低一些。

图中有一些亮点，应该是胶上有杂质。

GFP质粒提取为8个人一组，所以上图共有四个条带，说明提取成功，而且亮度高，说明含量高。

上面图3中的第一张是班里的14个人的，后两张是另外14个人的，只是曝光时间不同。

三张图中的所有条带整齐而且亮度高，表明大家的P38质粒的PCR扩增很成功。

在酶切点样中，右边第一个为Marker,第二个为质粒，第三个为酶切，后面几个为质粒的PCR。

图中条带较整齐，有些亮度不够，可能是含量较低。

酶切条带与Marker的条带基本一致，但亮度稍低，含量较低，但总体来说酶切还是不错的。

显色后，可以看到有两个PCR位点和酶切位点，一个质粒，说明杂交结果很好。

综合实验二.RT-PCR

扩增目的基因cDNA

（植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析；植物RNA提取、定量及电泳分析；RT-PCR扩增目的基因cDNA）

一．实验目的

1.掌握植物基因组DNA提取方法及注意事项，大分子量DNA分子的酶切分析。

2.掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。

3.学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

二．实验原理

CTAB可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。

通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液。

取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。

RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。

提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。

逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（dT）的引导下合成mRNA互补的DNA（complementalDNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。

这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

三．实验准备

1.实验材料：

普通小麦幼苗

2.实验试剂：

TtizolReagent，氯仿，点样缓冲液Loadingbuffer（10×），DEPC处理的ddH2O，溴乙啶（EB），异丙醇，RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，MMLV反转录酶，RNA抑制剂（RNasin），引物（P1、P2），Taq酶及10×PCR缓冲溶液，DNA抽提液，.氯仿：

异戊醇（24：

1），70%乙醇，EcoRⅠ酶，HindIII酶，TaqDNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmolMgCl2）

3.实验仪器：

微量移液器，研钵，灌装液氮，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统，PCR仪，恒