生物参考资料工艺学实验Word格式文档下载.docx
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葡萄糖40gMgSO42g
蛋白胨10g琼脂18g
酵母膏5g水1000ml
KH2PO45g
不加琼脂即为液体CM,分装20ml于250ml三角瓶中。
TTC上层培养基
葡萄糖5gTTC(红氮四唑)0.5g
琼脂10g水1000ml
分装,121℃灭菌15min。
TTC下层培养基
葡萄糖10gMgSO4▪7H2O0.4g
蛋白胨2g琼脂18g
酵母膏5g水1000ml
KH2PO41gpH5.5~5.7
MM甘培养基
酵母膏6.7g甘油20ml
水980mlpH5.5
琼脂粉18g
分装,121℃灭菌10min。
3、仪器设备
紫外诱变箱、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱
四、操作步骤
1、培养基配制:
配制实验过程中所需全部培养基并准备诱变及筛选所需的移液管、试管、平板等物品,121℃灭菌20min,其中TTC上层板培养基灭菌后备用,无需倒平板;
2、菌种活化:
取活化后的酵母菌1环,接入到三角瓶中液体CM培养基,200r/min、30℃振荡培养过夜;
3、菌悬液制备:
将培养好的酵母细胞4000r/min离心洗涤3次,调整细胞浓度为106/ml备用,实验过程无菌操作;
4、诱变:
取15-20ml菌悬液于灭菌空白平板内,磁力搅拌器转速为30r/min,调整与紫外灯管距离为20cm,开盖照射45-75s,盖上盖诱变结束;
5、稀释涂布:
将诱变后的菌悬液梯度稀释至10-6,于CM平板涂布,避光培养24-36h,选择菌落个数合适的平板备用;
6、点接:
将CM培养基平板上长出的菌落点种TTC下层平板上,30℃培养24-48h;
7、鉴定:
将TTC上层培养基溶化并冷却(不烫手)后,小心倾入TTC上层培养基上,使其刚好掩埋菌落。
等凝固后,30℃培养2~3h。
此时,平板菌落颜色会区分成红色、粉红色和白色。
呼吸缺陷型突变株为白色菌落。
8、复检:
用无菌牙签将在TTC鉴别培养基上生长的白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上。
注意点种时,先点MM甘培养基,后点种CM培养基,并在平皿上做好标记。
30℃培养24h观察实验结果。
五、实验结果分析
1、描述实验结果计算呼吸缺陷性酵母突变率,并分析实验过程中影响诱变效果的因素;
2、对比并参照其他小组实验结果,评价本小组实验过程中的利害得失
六、数据分析
突变率:
平板计数法
七、思考题
1、分析呼吸缺陷型突变株为白色菌落为白色,其它菌株红色、粉红色的机理。
2、呼吸缺陷性酵母筛选工作有何现实意义?
3、如果白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上培养后都有生长,讨论有哪些原因?
实验二红曲发酵及红曲色素的提取
1、了解红曲菌液体菌种的制备方法,为红曲发酵实验准备液体种子。
2、了解固体发酵的工艺过程,在实验室中小规模制备红曲。
3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法,以及掌握红曲色素色价的测定方法。
二、实验原理
红曲霉菌属真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、真子囊菌纲(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲菌属(Monascus)。
由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明,称为丹曲,至今已有1000多年的历史,很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。
红曲霉作为红曲的生产菌,以其可产生大量天然色素而著称。
红曲的应用主要有三方面:
食品色素、药物和发酵食品。
红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的天然色素,是红曲霉的次生代谢产物,具有热稳定性好,蛋白着色力强,色调柔和,可以提高加工制品对光和氧稳定等优点;
而且红曲色素无毒性、无致突变作用,安全性很高,因此红曲可提供安全性高的天然色素。
红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素,其中黄色素包括红曲素(Monascin)和黄红曲素(Ankaflavin),橙色素包括红斑红曲素(Rubropunctatin)和红曲玉红素(Monascorubin),紫红色素包括红斑红曲胺(Rubropunctamine)和红曲玉红胺(Monascoru-bramine)。
凡色素的呈色都与其结构有着密切的关系,结构的形式与变化内在决定着物质的呈色与变色。
大米经红曲菌固体发酵后产生了一系列红曲菌的代谢产物,但这些产物的量非常少,大米仍占固体发酵产物的绝大部分体积,为了降低运输成本,常常要对红曲菌的代谢产物进行提取和浓缩。
红曲的代谢产物中既有水溶性组分,也有脂溶性组分,因此可用80%的丙酮(丙酮:
水=80:
20)抽提。
用HCl或NaOH处理可以将其中的酸溶性组分、碱溶性组分和中性组分分开。
选择溶剂一般要注意以下四点:
①溶剂对所需成分的溶解度要大,对杂质溶解度要小,或反之。
②溶剂不能与天然药物成分产生化学反应,即使反应亦属于可逆性的。
③溶剂要经济易得,并具有一定的安全性。
④沸点宜适中,便于回收反复使用。
红色素能溶于80%的乙醇中,可通过萃取从米粒中提取出来,红曲色素在505nm处有最大的吸收峰,可用分光光度计来测定。
三、实验器材与试剂
1.菌种:
红曲5003
2.培养基
玉米面液体培养基(g/L):
蛋白胨20;
玉米面20;
酵母浸粉10;
硫酸镁0.5;
磷酸氢二钾1;
硫酸亚铁0.1;
pH6.0。
发酵培养基:
大米培养基
3、仪器与设备
恒温摇床,超净工作台,高压蒸汽灭菌锅、旋转蒸发仪、恒温培养箱等。
四、实验步骤
1、红曲液体种子制备:
配制制玉米面液体培养基。
500mL三角瓶中装玉米面液体培养基150mL,包扎后0.lMPa灭菌20分钟;
玉米面液体培养基灭菌冷却后,每瓶中接入1/4支红曲斜面菌苔(注意无菌操作);
接种后置30℃恒温摇床中180rpm摇瓶培养3天。
2、固体培养基制备及接种
1)浸米:
25℃以上浸米5—8h,大米吸收水分约在28%~30%。
2)蒸米:
将浸好的米用清水淋去米浆水,沥干,即可蒸米。
上汽火力要强,待全部圆气以后,蒸煮3~5min,出饭率在135%,饭粒呈玉色,粒粒疏松,不结团块。
蒸米不能熟透。
3)摊凉接种:
将蒸熟的曲料倒在超净工作台上迅速打碎团块,摊平冷却到30~32℃然后,每1kg米接种液体种子20ml,充分翻拌混合均匀,操作要迅速,以减少杂菌污染。
3、红曲固态发酵:
将曲料摊在曲盘内,厚度约3-5cm。
32~33℃保温保湿培养。
每天翻曲一次,观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”,使曲粒吸收一定水分,以利菌丝逐渐向内生长。
吃水方法:
一边拌曲,一边向曲盘中喷洒无菌水,使曲粒表面润湿并微有发胀。
培养3天后米粒逐渐成红色。
观察记录色素产生的过程。
培养5-7天后,固态发酵结束的红曲置于鼓风干燥箱内50~60℃鼓风干燥。
4、成品质量检查
外观检查:
曲粒表层光滑紫红,曲粒中心呈玉色,不得有空心和红心。
曲粒断面菌丝均匀,具有红曲特有的曲香,不得有酸气等不正常气味。
生物与理化项目检查:
水分12%以下,容量(l00mL)44.5~46.5g,淀粉含量59-62%,无细菌和其他霉菌污染。
5、红曲色素提取:
1)取200g固体发酵之红曲,在植物粉碎机中将其粉碎;
2)将红曲粉放于500mL三角瓶中,加入提取液(丙酮:
水=80:
20)300mL;
3)室温下浸提1天,每隔2小时摇动一次,过滤;
4)沉淀用同样提取液洗涤2次,每次100ml,合并滤液;
5)在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮(尚有水分);
6)用lmol/LHCl调残留液(约l00mL)的pH至3.0,加至分液漏斗中;
7)用150mL醋酸乙酯分次抽提;
8)以同样方法按下图分离碱(溶)性组分、中性组分和酸(溶)性组分,观察各组分的颜色;
9)将各分离到的组分在旋转减压蒸发仪中蒸去溶剂,低温保存。
五实验结果分析
1、根据实验结果绘制红曲色价生成曲线,分析影响红曲色素合成的因素
2、根据红曲色素分离实验结果描述红曲色素组分及特性
六、参数测定
红曲色价测定:
1)称取红曲米样品0.5g,放入带有刻度的lOmL具塞试管中;
2)加入80%的乙醇8mL,摇匀, 60℃水浴保温萃取0.5h;
3)取出冷却,用普通定性滤纸过滤入lOmL量筒中,用80%乙醇洗涤残渣2次,合并滤液,并用80%乙醇定容至10mL;
4)以80%乙醇作对照,在505nm波长下,用lcm比色皿测定样品的吸光度。
5)计算:
红曲色价(以lg样品计)=A505×
lO×
2
注意:
发酵后期,若红色素产生量多,可稀释后测定。
七、注意事项:
1.无水Na2S04可回收,反复使用,不要扔掉。
2.有机溶剂易燃,注意远离火源,原则上应在通风柜中进行。
八、思考题:
1.比较固态发酵与液体发酵的优缺点,并指出固体发酵的应用范围。
2.萃取后米粒中仍带有红色,是否会对结果产生影响?
附:
红曲代谢产物分离工艺流程图
实验三苏云金芽孢杆菌的培养及粉剂制备
一、实验目的
1、学习苏云金芽孢杆菌的种子制备、发酵生产和产品检测的方法;
2、掌握苏云金芽孢杆菌发酵生产的调控原理。
二、实验原理
苏云金芽孢杆菌是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌,是应用最广的一种微生物杀虫剂,它的主要活性成分是一种或数种杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs),又称δ-内毒素,对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫,以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性,而对非目标生物安全因此,Bt杀虫剂具有专一、高效和对人畜安全等优点目前苏云金杆菌商品制剂已达100多种,是世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的微生物杀虫剂,因而倍受人们关注。
杀虫伴孢晶体蛋白本身无毒,在酸性条件下会变性失去作用,对于人和哺乳动物,当它进入机体后,马上在胃酸作用下变性,而在腔肠动物体内,没有酸性环境,不会马上变性,在碱性条件下马上分解,释放毒性蛋白,起到对集体的毒害作用。
利用发酵法可实现苏云金芽孢杆菌的大规模培养,最后加工成含有芽孢、伴孢晶体及其他毒素的粉剂。
三、实验材料
一)设备
发酵罐、摇床、显微镜、干燥箱、高速离心机
二)菌种
苏云金芽孢杆菌
三)培养基(%)
斜面培养基
酵母粉0.5,蛋白胨1,NaCL0.5,pH7.0
种子培养基:
葡萄糖2,酵母浸粉0.5,蛋白胨0.5,K2HPO40.1,MgSO40.05,硫酸铵0.5,pH7.0
发酵培养基:
葡萄糖3,酵