小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定Word文件下载.docx
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sMAC刺激小胶质细胞后与对照组相比细胞脱落增加（），而活力正常.刺激后12hNO及TNFα分泌量比对照组显着增加（P ），不同时相观察sMAC刺激后小胶质细胞TNFα分泌量均显着高于失活sMAC（）.结论：
sMAC刺激小胶质细胞后分泌NO及TNFα增多，并且可降低小胶质细胞黏附力而不影响细胞活力，推测sMAC对小胶质细胞具有炎性刺激效应.
【关键词】C56；
补体攻膜复合物；
小神经胶质细胞；
显微镜检查，共焦；
细胞活力;
一氧化氮；
肿瘤坏死因子
0引言
补体系统是机体防御外侵的天然免疫屏障,由30余种血清蛋白组成，具有级联酶促和自我调节反应，可通过经典或旁路途径激活，形成膜攻击复合物产生杀伤效应.对MAC的早期研究仅局限于对红细胞的溶破，后期研究显示，非致死量的MAC结合到有核细胞可刺激细胞发生多种病理、生理变化，如产生氧自由基、细胞因子，诱导膜蛋白表达等，在多种疾病的发生和发展中发挥作用，该效应被称为补体攻膜复合物的亚溶破刺激效应［1］.迄今，sMAC对内皮细胞、淋巴细胞、肾小球细胞等多种有核细胞的刺激效应已有报道［2］，而对中枢神经系统中小胶质细胞的亚刺激效应至今报道甚少.我们以原代小鼠小胶质细胞为靶细胞,提取人血清补体优球蛋白,体外组装小胶质细胞sMAC亚溶破模型，并检测其炎性反应,初步探讨sMAC对小胶质细胞的亚刺激效应.
1材料和方法
材料SPF级近交系Balb/c小鼠（1~2d）购自第三军医大学实验动物中心.激光共聚焦显微镜TCSNT购于德国Leica仪器公司.小鼠抗人MAC新抗原单克隆抗体AE11，小鼠抗人CD3单克隆抗体UCHT1，CCK8试剂盒（Dojindo日本），NO检测试剂盒，TNFα检测试剂盒（BD美国），急性期患者血清取自西南医院检验科；
正常人血清取自10人以上义务献血员.
方法
小鼠小胶质细胞培养体外培养小鼠小胶质细胞,免疫组化鉴定小胶质细胞纯度，95%方满足实验要求.
补体优球蛋白C56的提取及活性鉴定急性期患者血清与4g/L酵母多糖，mmol/LMg2+37℃作用1h后离心，取血清用微量补体反应性溶血法鉴定补体C56活性，收集活性样品用 mol/LPB（pH）透析，所得优球蛋白沉淀溶于含100g/L甘油的mol/LPBS（pH）中，即为功能纯C56制品.
比色实验确定sMAC亚溶破剂量将小胶质细胞以2×
108/（L・孔）接种于96孔培养板，漂洗后，每孔中加入含1mmol/LEDTA无血清IMDM养基100μL,不同释度功能纯C5610μL，37℃孵育15min，再加入1∶20NHS，37℃孵育1h组装sMAC.每孔中加入10μLCCK8试剂，37℃30min，于450nm波长处测定A值.
鉴定sMAC小胶质细胞上的沉积将2×
104小胶质细胞接种于自制盖玻片小室，生长至80%融合，漂洗，加入亚溶破剂量C56，37℃15min；
再加入EDTANHS，冰上孵育60min于细胞表面组装sMAC.固定并封闭，加入小鼠抗人1∶10sMAC单克隆抗体，同时设立小鼠抗人CD3IgG同型对照和不加一抗阴性对照，4℃过夜；
FITC标记的羊抗小鼠二抗，4℃1h，漂洗后磷酸甘油封片，4℃避光保存，48h内用LSCM观察.
刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率细胞分为未刺激，sMAC，同浓度C56，1∶20EDTANHS，失活sMAC共5组.将C56与NHS于37℃提前混合孵育30min，使sMAC失活.各组细胞37℃孵育24h，收集温育液，离心，加少量培养液重悬，以计数板计算脱落细胞数，同时以台盼蓝拒染法，计算细胞存活率.
对小胶质细胞NO和TNFα合成的影响细胞分组同前，37℃孵育12h，收集上清，离心后检测各组NO与TNFα分泌量.
统计学处理：
应用SPSS软件处理，所有数据用x±
s表示，组间采用t检验和方差分析，为统计学上有显着差异.
2结果
亚溶破模型的建立以人血清补体C56与NHS体外组装小鼠小胶质细胞sMAC亚溶破模型.CCK8比色法检测细胞溶破情况显示：
当C56稀释度1∶480时,sMAC活性升高，小胶质细胞溶破增多；
当C56稀释度1∶480后,sMAC活性降低，小胶质细胞溶破减少.故确立C561∶480，NHS1∶20为小胶质细胞亚溶破补体量.
鉴定sMAC在小胶质细胞表面沉积以亚溶破剂量C56及EDTANHS体外组装sMAC，LSCM观察可见细胞膜表面sMAC沉积明显，同时小胶质细胞膜完整性好，形态无明显变化，提示所加入的sMAC是亚溶破剂量的sMAC.
图1激光共聚焦显微镜鉴定sMAC组装LSCM×
200
刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率亚溶破剂量sMAC刺激细胞24h后，细胞脱落增多（）；
台盼蓝染色见sMAC刺激后脱落细胞大多数为存活细胞，其余对照组则大部分为死亡细胞.由此推断，sMAC可降低细胞黏附力，而不影响细胞活力.
表1sMAC刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率
vs未刺激组、C56单独组、EDTANHS组和失活sMAC组.
亚溶破sMAC对小胶质细胞NO和TNFα合成的影响5组小胶质细胞37℃孵育12h后ELISA检测上清中NO与TNFα分泌量.sMAC刺激后小胶质细胞分泌NO与TNFα显着增高，同各对照组相差显着（，图2）.
vs未刺激组、C56单独组、EDTANHS组和失活sMAC组.
图2sMAC对小胶质细胞分泌炎性因子NO与TNFα的影响
3讨论
MAC作为补体激活的终末因子，对不同细胞可产生不同效应，其对细胞的杀伤功能主要取决于C9结合量，CD59分子可通过阻碍C9的聚集而调控MAC的组装，是重要的补体膜调节蛋白［3］，同时，有核细胞可通过内吞等方式将MAC清除，防止细胞溶破.补体在进化过程中存在高度保守性，同种和异种间补体可相互作用，产生不同的刺激效应.如Adler等［4］以NHS和C56分子在大鼠肾小球系膜细胞上组装sMAC,刺激细胞活化产生活性氧自由基；
Halperin等［5］证实人sMAC可促进小鼠3T3细胞细胞有丝分裂和再生增加.我们采用不同浓度人补体C56与NHS中C7～C9成分体外确定了小鼠小胶质细胞sMAC亚溶破剂量，LSCM验证sMAC小胶质细胞的沉积，成功建立了小胶质细胞sMAC亚溶破模型，为后续功能实验奠定了基础.
sMAC可促进单核/巨噬细胞脂质代谢增强,炎症介质和氧自由基大量释放，早期可防御外侵、维持内环境稳定，而后期则对机体产生损伤.小胶质细胞是髓系来源的CNS单核细胞，对神经系统炎症修复及免疫调节起重要作用.我们用sMAC刺激小胶质细胞后观察细胞脱落和活力改变，结果示sMAC能使细胞脱落增加而活力不受影响，说明sMAC可降低小胶质细胞的黏附功能，其机制可能为改变细胞外基质成分，对细胞骨架重排的结果［6］.sMAC刺激小胶质细胞12h后检测到细胞分泌炎性介质NO和TNFα增加，其余对照组中，EDTA抑制补体活化不产生MAC，C56单独无炎性刺激效应；
37℃孵育下补体C7～C9,S蛋白与C56可直接结合形成失活sMAC，不能与细胞结合，各组均无明显刺激效应.
NO和TNFα是CNS炎性病变中重要的致炎因子，NO具有神经毒性，可导致神经元的损伤和死亡，TNFα能自分泌促进白细胞浸润，也可上调神经元MHCⅠ表达，更易受毒性T细胞攻击；
并且TNFα的分泌可进一步诱导小胶质细胞NFκB和PKC通路活化，释放NO,花生四烯酸等介质促进炎性爆发［7-8］.本研究显示sMAC在CNS炎症的早期阶段可能对小胶质细胞有炎性刺激效应，为今后探讨补体在CNS炎性疾病中的发病机制提供了线索，但就其信号传导途径尚待进一步研究.
【参考文献】
［1］ColeDS,MorganBP.Beyondlysis:
Howcomplementinfluencescellfate［J］.ClinSci,2003,104（5）:
455-466.
［2］RusH,CudriciC,NiculescuF.TheRoleoftheComplementSysteminInnateImmunity［J］.ImmunolRes,2005,33
（2）:
103-112.
［3］HeC,ImaiM,SongH,etal.ComplementinhibitorstargetedtotheproximaltubulepreventinjuryinexperimentalnephroticsyndromeanddemonstrateakeyroleforC5b9［J］.JImmunol，2005,174（9）:
5750-5757.
［4］AdlerKS,BakerPJ.JohnsonRJ,etal.Complementmembraneattackcomplexstimulatesproductionofreactiveoxygenmetabolitesbyculturedratmesangialcells［J］.JClinInvest,1986,77,762-767.
［5］HalperinJA,TaratuskaA,NicholsonWellerA.TerminalcomplementcomplexC5b9stimulatesmitogenesisin3T3cells［J］.JClinInvest，1993,91,1974-1978.
［6］郭啸华，廖立生.补体攻膜复合体致肾小球脏层上皮细胞黏附性改变研究［J］.细胞生物学杂志，1999,21（3）:
128-132.
［7］NguyenVT,BemvenisiteEN.CriticalroleoftumornecrosisfactorαandNFκBininterferonγinducedCD40expressioninmicroglia/macrophages［J］.JBiolChem,2002,277（16）:
13796-13803.
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