荧光检测温习题参考答案Word格式文档下载.docx

荧光检测温习题参考答案Word格式文档下载.docx

《荧光检测温习题参考答案Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光检测温习题参考答案Word格式文档下载.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

1）光化发光2）化学荧光3）生物荧光。

按荧光素的标记进程可分为：

1）免疫荧光2）组织荧光3）诱导荧光

5有哪几种荧光现象？

I次荧光现象：

固有或自发荧光；

一经辐射就可发出荧光的物质。

II次荧光现象及荧光色素（标记物）又称继发荧光；

样品分子不能或只能发出很弱的荧光，对此类分子需先经荧光色素标记结合或插入到不发光的大分子中去，依照荧光探针的荧光分析大分子。

6阻碍荧光强度（If）的因素

1光化分解：

荧光物质吸收光能后，某些键断裂，致使荧光弱。

制片时应避光。

2荧光淬灭：

（1）温度淬灭：

加速震动弛豫而丧失振动能量；

增加分子热运动高温荧光分子与液基环境中分子碰撞。

温度适宜或低温。

（2）浓度淬灭：

浓度大时发光分子在样品中散布不均，深部的分子吸收不到光子，量子产额反而小。

生成二聚体或多聚体，改变吸收光谱，If降低。

（3）杂质淬灭：

静态淬灭，杂质与荧光分子组成另一种化合物。

环境净化。

碰撞、转入三重态淬灭。

3pH阻碍：

破坏荧光物质环链结构，芳香族化合物的酸、碱功能团对pH灵敏。

7半波宽概念：

最大透光度Tmax波长1/2处对应的两波长差（λ1-λ2）也称带宽（Bandwidth）,带宽窄那么光色纯。

第二章荧光成像检测

1光学显微镜分辨率概念及简易计算公式

2阻碍光学显微镜分辨率的要紧因素？

阻碍分辨率的因素为衍射效应：

圆斑像AIRY斑，阻碍分辨率。

3聚光镜与物镜孔径光阑的对应调剂？

目的：

产生与物镜相应的光束，使镜像的反差和焦深处于最正确状态。

不同倍率物镜有不同的NA值，改换物镜聚光镜NA应做相应调剂。

观看：

与物镜NA一致（100%），以取得较好的分辨率；

照像：

相当于物镜NA的60~80%,以取得较好的反差、焦深。

4光学显微镜的有效放大＝所用物镜NA值的500～1000倍

5荧光量子效率（QE）

荧光量子效（产）率=放射量子数／吸收量子数

6医学实验中荧光检测经常使用的荧光检测传感器是哪两种？

1转换光学信号为电子信号-光学传感器,2彩色CCD

7显微镜照相术的概念?

将显微镜视场中的微观图像记录为放大图像的技术

8阻碍CCD成像成效的要紧因素是什么?

温度和灵敏度，CCD工作时，表面会产生热量，使得在芯片形成暗电流，暗潮将增加噪音、降低信噪比、致使降低成像质量。

9CCD成像放大倍率的计算公式

显示或照片倍率＝OBJ倍率×

光学适配器倍率×

显示或照片对角线长度／CCD对角线长度

10荧光显微镜CCD成像与激光共焦显微镜成像的比较

数字CCD优势：

价低，利用简便，成像块，测得FI同LSCM，彩色还原好，图像近于镜下，光化淬灭损害小。

Ratio测钙、利用TC板，适于标本：

薄、层次简单。

缺点：

厚标本图像质量差，无光切功能，整合功能配置价钱不菲

激光共焦扫描显微镜，优势：

分辨率高，光切片，3D空间立体结构观测，集成荧光分析功能。

本钱高（专人、耗材），光化淬灭损害较大

11免疫荧光染色的目的

将抗体标记上荧光素（如FITC、TRITC），与细胞内相应抗原（目标蛋白）结合后，通过观看、检测具有特点性的荧光，定性、定位及定量的显示和检测细胞内目的蛋白

12.免疫荧光染色经常使用方式

直接法、间接法和双标记法

13.阻碍免疫荧光染色结果的要紧因素有

1）荧光染料标记的抗体的浓度，2）溶液的pH值，3）溶剂

14.举例说明自发荧光要紧包括哪些

动物中一样为黄素类和卟啉类，植物中为叶绿素容易产生自发荧光。

脂褐素的自发荧光，弹力蛋白和胶原UV激发下呈黄绿色荧光，培育死细胞很容易产生自发荧光。

15.免疫荧光染色前对细胞接种密度的要求

细胞密度：

依如实验目的调整细胞接种密度。

对细胞个体进行形态学观看和定位荧光信号：

细胞密度稍稀疏。

使细胞充分伸展，显示出其应有的形态和结构；

但也要注意保证视野内有必然数量的细胞，以便选取有代表性的细胞采图，要求细胞所占面积不低于视野的20%。

定量测定荧光强度（观看某种蛋白的表达量）：

细胞密度应稍高。

用于做大量细胞的统计定量，细胞至少要占到视野面积的80%；

这时细胞要布满视野但彼此之间还有间隙，细胞排列均匀，不聚堆拥堵，避免细胞间挤压变形，阻碍定量结果。

达到通常所说的亚融合状态。

16荧光显微镜观看免疫荧光染色需要设置的对照及意义

正确设置对照组（超级必要）：

1.阳性对照：

已知抗原阳性的样品与待测样品同时进行免疫荧光染色，对照样品呈阳性结果，用于查验免疫荧光染色全进程是不是符合要求，包括孵育温度、时刻，一抗、二抗是不是有问题，分析可能缘故。

若是阳性对照呈阴性，那么说明实验进程有问题，需要对每一个条件加以分析改良。

2.阴性对照：

已知抗原阴性的样品作对照，对照样品应呈阴性结果。

包括空白对照（PBS代替一抗）和替代对照（非免疫血清朝替一抗），用于排除非特异性染色。

若是阴性对照呈阳性表达，一样检测样品的结果也是不可信的。

3.不染色细胞空白组：

不经免疫荧光染色，直接上机观看，用于检测由于细胞本身或固定造成的细胞自发荧光。

17共聚焦扫描显微镜（LCSM）光学成像原理

检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面之外被激发的荧光不能进入检测针孔--高分辨率的光学切片

18共聚焦扫描显微镜（LSCM）与传统荧光显微镜比较的优势

1）提高了灵敏性及分辨率，2）扩大获取信息范围，3）实现了图像三维重建，4）客观记录荧光信息，5）同时显示多种标记物

19.概念：

荧光漂白恢复（FRAP）：

经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照射后,荧光物质的光化学结构被破坏,荧光强度下降,但此处荧光强度会渐渐恢复,荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散的速度,或分子运动速度。

20.概念：

荧光共振能量转移（FRET）：

受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一进程称荧光能量共振转移。

能量的提供者叫供体荧光素，能量的同意者叫受体荧光素。

第三章荧光光度检测

1荧光分光光度计的构造示用意

光源→激发单色器→样品杯→发射单色器→检测器→电子放大及操纵→显示

2微孔板荧光检测在医学实验的应用

1）利用报告基因检测目标基因的表达：

将报告基因引入细胞DNA使之与某一特定分子事件相关，能够为这一分子事件带来可测性。

通常检测的分子事件是基因功能，具有可测性的是发光。

目前，市场上有许多发光报告基因出售。

包括：

萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase），β－半乳糖苷酶（B-galactosidase）等。

2）ATP水平测定：

所有活细胞都含有ATP。

ATP能够从细胞中提掏出来，用萤火虫荧光素酶检测。

荧光强度与样品中ATP的含量成比例，相应的与提取ATP所用的细胞数成比例。

能够检测样品中的所有微生物，因此被用于检测水中的大肠杆菌含量，用于药品，化妆品，牛奶和其它食物的微生物操纵，测定土壤和沉积物中的全数活生物含量，评判抗生素对微生物生长的阻碍，了解不同药物对哺乳动物细胞的阻碍等。

3）离子测定：

如细胞内钙离子测定。

3活细胞内钙离子浓度测定的方式

即从测量出的荧光信号中定量地计算出钙离子浓度。

关于单波长激发或发射的荧光指示剂，可按下式计算[Ca2+]=Kd（F一Fmin）/（Fmax一F），Kd：

荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数，Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度。

关于双波长的荧光指示剂，用率比值信号来计算细胞内游离Ca2+浓度，用下式计算细胞内游离Ca2+浓度，[Ca2+]=Kd（Fd/Fs）（R一Rmin）/（Rmax一R）Kd：

荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数.Fd和Fs别离表示荧光剂没有结合Ca2+和被Ca2+饱和时的荧光强度.，R为实验观看到的荧光比值.

Rmin为细胞内荧光剂最小量结合Ca2+时的荧光比值.，Rmax为胞内荧光剂被Ca2+饱和时的荧光比值.

4fura2指示剂测钙原理

Fura2:

由紫外激发的一种率测量指示剂，因有较强的亲水性，难以进入细胞，在其负性基团部位结合上亲脂的乙酰羟甲基酯成为Fura-2/AM后，与细胞温孵时很容易透过细胞膜，胞浆内的酯酶可将Fura-2/AM水解成Fura-2而滞留在胞浆内，后者与胞内游离的钙离子结合形成Fura-2-钙离子复合物。

当Fura-2与Ca2+结合后吸收峰发生改变，在最大和最小Ca2+浓度时,它的最大吸收峰别离在335nm和363nm处，在作率测量时，常常选用的波长是340nm和380nm；

结合钙和游离钙形式Fura2的发射峰都是510nm，其发射光的强度与钙离子的浓度呈比例关系

第四章荧光细胞激活分选、分析

1简述流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪的工作原理：

将待测标本制备成单细胞悬液,经荧光染色后由气压装置送入流动室,流动室由样品管和鞘液管组成,鞘液管充满流动的鞘液,鞘液流与样品流压力不等,当二者压力差达到必然程度时,鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列,逐个进入激光聚焦区。

经激光束激发,产生散射光和荧光信号。

通过一些波长选择通透性滤光片,即可将不同波长的散射光和荧光信号区分开来。

散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送运算机处置,可在运算机上直观地统计染上各类荧光染料的细胞各自的百分率。

2简述流式细胞仪的构造

1）流动室及液流驱动系统2）激光光源及光束成形系统3）光学系统4）信号检测与存贮、显示、分析系统5）细胞分选系统

3前向角散射概念（FSC，ForwardScatter）

前向角散射（FSC，ForwardScatter）：

0°

散射,与被测细胞的大小和面积有关，确切说与细胞直径的平方紧密相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各类碎片及鞘液中的小颗粒，以幸免对被测细胞干扰。

4侧向角散射概念（SSC，SideScatter）

侧向角散射（SSC，SideScatter）：

90°

散射,对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为灵敏，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。

5试述AnnexinV/PI染色应用流式细胞仪检测细胞凋亡的大体原理

大体原理：

细胞凋亡初期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。

PS是一种带负电荷的磷脂，正常要紧存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂散布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。

AnnexinV是一种Ca2+依托的磷脂结合蛋白,具有易于结合到磷脂类如PS的特性,对PS有高度的亲和性。

该蛋白可充当灵敏的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。

6简述PI（碘化丙啶）染色时显现细胞凋亡峰的原理

在凋亡细胞内，由于细胞核的解聚和凋亡小体的形成，核内的总DNA含量下降。

由于在凋亡细胞内DNA含量下降，在G1峰前显现亚二倍体峰，称亚G1期峰，又称凋亡细胞峰。

7试述PI（碘化丙啶）染色应用流式细胞仪检测细胞周期的原理

碘化丙啶是一种双链DNA的荧光染料，能够和DNA结合，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1／G0期具有二倍体细胞的DNA含量（2N）,而G2/M期具有四倍